伯小霞，崔慧斐

(1．山東大學 藥學院，山東 濟南 250012;2．(山東大學)國家糖工程技術研究中心，山東 濟南 250012;3．東營天東生化工業(yè)有限公司，山東 東營 257067)

依諾肝素鈉相對分子量的EP與USP分析方法對比研究

伯小霞1，3，崔慧斐1，2

(1．山東大學 藥學院，山東 濟南 250012;2．(山東大學)國家糖工程技術研究中心，山東 濟南 250012;3．東營天東生化工業(yè)有限公司，山東 東營 257067)

目的 以國產依諾肝素鈉和其原研藥為樣品，比較歐洲藥典(EP)和美國藥典(USP)測定依諾肝素鈉相對分子質量(Mr)方法的差異，為國內該品種的藥典標準制定提供參考。方法 采用這兩種方法分別檢測了10批國產依諾肝素鈉原料藥和2批原研藥注射液LOVENOX的Mr情況。結果 USP方法測得平均Mr均較EP方法結果偏高在200以內，Mr2 000以下組分比例EP方法偏高，而Mr2 000～8 000組分比例USP方法偏高，但差距均在4%以內。國產依諾肝素鈉Mr與原研藥的基本一致。結論 EP和USP方法分析依諾肝素鈉Mr結果較為接近。

依諾肝素鈉;相對分子量質量;歐洲藥典;美國藥典

依諾肝素鈉是一種低分子肝素鈉鹽，系通過對豬腸黏膜肝素的芐基酯衍生物進行堿解聚β-消除而獲得。與其他低分子肝素一樣，依諾肝素鈉也有相對分子質量(Mr)及分布要求，并作為其鑒別的重要一項。依諾肝素鈉平均Mr范圍為3 800～5 000，Mr小于2 000的級分比例應為12．0% ～20．0%，2 000～8 000的級分比例應為68．0% ～82．0%。

歐洲藥典(EP)和美國藥典(USP)中均收錄了依諾肝素鈉，都采用高效凝膠滲透色譜進行Mr的檢測，其具有簡便、快速和重現(xiàn)性好的特點［1］，但兩者的分析方法卻并不完全相同［2-3］。本文采用這兩種藥典方法分析了國產依諾肝素鈉和原研藥LOVENOX注射液的Mr情況。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Waters515泵，2487紫外檢測器，2414示差檢測器，7725i手動進樣器，81437柱溫箱);Empower工作軟件;Sartorius電子天平;Millipore超純水機。

低分子肝素Mr測定用對照品(批號2．0，數(shù)均分子質量3 800)、EDQM依諾肝素鈉對照品(批號4．0)，歐洲藥品質量管理局(EDQM);USP依諾肝素鈉Mr校正對照品A(批號F0H193)、USP依諾肝素鈉Mr校正對照品B(批號F0H241)、USP依諾肝素鈉對照品(批號F0I110，標示Mr4 432)，美國藥典委員會(USP);10批依諾肝素鈉(批號KE110414等)，東營天東生化工業(yè)有限公司;2批Lovenox依諾肝素鈉注射液(批號7880，7881)，賽諾菲-安萬特公司;其余為國產優(yōu)級純或色譜純試劑。

2 方法

2．1 EP 分析方法［2］

2．1．1 試液的配制 流動相:2．84%硫酸鈉溶液(用稀硫酸調節(jié)pH至5．0)。

對照品溶液:精密稱取歐洲藥典低分子肝素Mr測定用對照品適量，用流動相制成每1 mL約含10 mg的溶液。

供試品溶液:稱取依諾肝素鈉適量，用流動相稀釋成每1 mL約含10 mg的溶液。

2．1．2 色譜條件與系統(tǒng)校正 以TSKguardcolumn-SWXL和TSKgelG2000SWXL為色譜柱;柱溫為30℃;進樣量為 25 μL;流速為 0．5 mL/min;紫外檢測器連接色譜柱出口，示差檢測器連接紫外檢測器出口;檢測波長為234 nm。進樣1%葡萄糖溶液，記錄示差色譜圖，計算理論板數(shù)與對稱因子，理論板數(shù)應大于20 000，對稱因子應為 0．8 ～1．5。進樣 0．04%疊氮化鈉溶液，準確測量紫外檢測器和示差檢測器之間的時間差。

2．1．3 分析計算 參考 EP7．0版低分子肝素 Mr鑒別項下方法計算［2］。

2．1．4 EP 分析方法的驗證

2．1．4．1 精密度試驗 按上述的方法操作，計算得RSD≤2．0%。

2．1．4．2 準確度試驗 進樣兩針EDQM依諾肝素鈉對照品，其結果在標準范圍內且兩針對照品的Mr分布差值≤0．5%，Mr的差值≤50。

2．2 USP 分析方法［3］

2．2．1 試液制備 流動相:0．5 mol/L硝酸鋰溶液。

USP依諾肝素鈉對照品溶液:取USP依諾肝素鈉對照品適量，用流動相稀釋成每1 mL約含10 mg的溶液。

USP依諾肝素鈉Mr校正對照品A和B:移取流動相1 mL到USP依諾肝素鈉Mr校正對照品A和B瓶中，溶解混勻。

供試品溶液:取依諾肝素鈉適量，用流動相稀釋成每1 mL約含10 mg的溶液。

2．2．2 色譜條件 以 TSKguardcolumnSWXL和 2根TSKgelG2000SWXL為色譜柱;進樣量為20 μL;流速為0．6 mL/min;運行時間:50 min。

2．2．3 分析計算 參考USP 33版依諾肝素鈉Mr鑒別項下方法計算［3］。平行樣Mr相差不超過50，對照品Mr計算結果與標示的Mr偏差小于150，則通過系統(tǒng)適用性試驗。同樣的方法，計算Mr分布。平行樣分布值相差不超過0．5%。

2．2．4 USP 分析的驗證

2．2．4．1 精密度試驗 按上述的方法操作，計算得RSD≤2．0%。

2．2．4．2 準確度試驗 進樣兩針USP依諾肝素鈉對照品，每一針的Mr與標簽上標示的Mr(4 432)相差不超過150，兩個對照品Mr之差不超過50。

2．3 采用EP和USP方法對10批依諾肝素鈉和2批Lovenox注射液進行分析

按照EP和USP的檢驗方法，分別分析10個批次的依諾肝素鈉樣品和2批賽諾菲-安萬特的Lovenox依諾肝素鈉注射液樣品。

3 結果

3．1 標準品譜圖

EP和USP標準品譜圖見圖1～3。

圖1 EP對照品紫外與示差疊加譜圖(1-紫外譜圖，2-示差譜圖)Fig．1 The UV and RI chromatograms of heparin low-molecular-mass for calibration CRS

圖2 依諾肝素鈉Mr校正對照品A色譜圖Fig．2 The chromatogram of Enoxaparin sodium Molecular Weight Calibrant A

圖3 依諾肝素鈉Mr校正對照品B色譜圖Fig．3 The chromatogram of Enoxaparin Sodium Molecular Weight Calibrant B

3．2 樣品Mr測定結果

國產依諾肝素鈉和Lovenox注射液色譜圖見圖4～5。EP和USP分析10批依諾肝素鈉樣品和2批Lovenox樣品的結果見表1。從表1可看出，USP方法Mr均較EP方法結果偏高，最大差值約為200，最小僅為2;Mr＜2 000的比例EP分析方法偏高，差值約為2% ～3%;Mr2 000～8 000的比例USP方法偏高，差值約為1% ～3．5%。USP方法的Mr結果更偏向范圍的中心，EP方法的結果更偏向范圍的邊緣，尤以Mr分布比例明顯。從上述數(shù)據亦可看出，10批國產依諾肝素鈉樣品與2批Lovenox依諾肝素鈉注射液在Mr和Mr分布方面無顯著差異。

圖4 國產依諾肝素鈉樣品EP方法示差譜圖Fig．4 The RI chromatogram of the domestic samples in EP method

4 討論

低分子肝素最初是在1994年被英國藥典收載入其增補版中，收錄了低分子肝素總則和5種低分子肝素產品，現(xiàn)在EP中收載的低分子肝素內容與英國藥典相同［4］，且自收錄后該分析方法始終沒有變更。USP自31版增補版二開始收錄依諾肝素鈉，2008年12月1日生效。

兩個藥典方法所采用的測定用對照品不同。USP配有自己的依諾肝素鈉Mr測定用對照品，包括7個已知分子量的窄分布Mr校正對照品(圖2～3)，另有一個Mr標示為4 432的對照品，對檢驗過程和結果起到指導作用。EP則采用數(shù)均分子量為3 800的寬分布對照品，具有普適性，適用于所有低分子肝素Mr的測定，標準曲線范圍較廣。

圖5 Lovenox注射液EP方法示差譜圖Fig．5 The RI chromatogram of the branded in EP method

表1 EP和USP方法分析10批依諾肝素鈉樣品和2批Lovenox樣品結果Tab．1 The results of 10 batches of Enoxaparin sodium samples and 2 batches brand Injection Lovenox Enoxaparin sodium in EP and USP method

雖然兩個藥典方法均采用三階標準曲線計算，但三階標準曲線的建立方法有所不同。EP方法是采用數(shù)均分子質量為3 800的寬分布對照品，利用紫外和示差雙檢測器，依據紫外與示差譜圖的峰面積得出每個時間點的Mr，以對照品溶液示差色譜圖的保留時間對示差色譜圖中每個時間點的lgMr擬合得到三階方程。USP方法則是以USP依諾肝素鈉Mr校正對照品A和B譜圖中7個峰的保留時間對各峰的Mr，用GPC軟件得到三階方程。以依諾肝素鈉標準品為例，經計算發(fā)現(xiàn)，標準曲線中以lgMr還是直接以Mr來建立方程是EP和USP結果略有差異的主要原因。當EP方法標準曲線以對照品溶液示差色譜圖的保留時間對示差色譜圖中每個時間點的Mr來擬合，計算依諾肝素鈉標準品結果，Mr較原結果略有升高，范圍在100左右，而Mr分布變化非常大，分布集中在2 000～8 000之間，超出標準范圍。

從本文對比研究來看，兩種藥典方法對依諾肝素鈉Mr的測定結果較為接近，Mr差別在200以內，2 000以下組分和2 000～8 000組分的比例差距均在4%以內。EP方法與USP方法相比，方法復雜，分析過程繁瑣，亦沒有標示Mr的對照品作參考，分析過程易出現(xiàn)偏差，故筆者更傾向于USP方法。

中國藥典尚未收錄依諾肝素鈉和低分子肝素，國家食品藥品監(jiān)督管理局于2005年頒布的國家藥品標準WS1-(X-149)-2005Z低分子量肝素鈉中規(guī)定了低分子肝素鈉Mr檢測，其對照品采用EDQM低分子肝素Mr測定用對照品，檢測儀器要求、分析方法和計算均與EP一致［5］。Mr作為依諾肝素鈉同時也是低分子肝素鑒別項目之一，是質量標準中不可缺少的一項。本文為該品種Mr國內標準的制定具有參考意義。

［1］ 范慧紅，劉金秀，徐康森．低分子肝素分子量及其分布的測定［J］．中國藥學雜志，1999，34(5):332-334．

［2］ 歐洲藥典［S］．7．0 版．2011:2151-2153．

［3］ 美國藥典［S］．33版．2010:2253-2256．

［4］ 范慧紅，李 京．低分子肝素質控研究狀況介紹［C］//2007年全國生化與生物技術藥物學術年會論文匯編，2007:530-532．

［5］ WS1-(X-149)-2005Z，低分子量肝素鈉［S］．

Comparative study on relative molecular weight analysis of Enoxaparin Sodium by EP and USP methods

BO Xiao-xia1，3，CUI Hui-fei1，2
(1．School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China;2．National Glycoengineering Research Center(Shandong University)，Jinan 250012，China;3．Dongying Tiandong Biochemical Industry Co．，Ltd．，Dongying 257067，China)

Purpose To analyze the difference of the relative molecular weight(Mr)analysis method of Enoxaparin Sodium in european Pharmacopoeia(EP)and the United States Pharmacopoeia(USP)through the analysis of domestic samples and the branded，and to provide some opinions for Enoxaparin Sodium domestic standard．Methods Ten batches of Enoxaparin Sodium samples and 2batches brand In-jection Lovenox Enoxaparin Sodium were analyzed in EP and USP method．Results The average Mrby EP method was higher than that by USP method with difference of less than 200．The percentage of less than 2 000 by EP method was higher，and that of 2 000 ～8 000 by USP method was higher and both differences within 4%．The Mrof domestic samples was comparable to the branded．Conclusion The results of Mrof Enoxaparin Sodium by EP method were closed to those by USP method．

Enoxaparin Sodium;relative molecular weight;European Pharmacopoeia;United States Pharmacopoeia

R927．1

A

1005-1678(2012)06-0818-04

2012-05-05

十一五“重大新藥創(chuàng)制”項目(2008ZX09504)

伯小霞，女，在職碩士研究生，主要從事生化藥物研究與檢測;崔慧斐，通訊作者，教授，碩士生導師，Tel:0531-88380288，E-mail:cuihuifei@sdu．edu．cn。