任 敬

(石家莊醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 基礎(chǔ)部 生化教研室，河北 石家莊 050071)

利用反向膠束技術(shù)從微紫青霉菌中提取木聚糖酶的初步研究

任 敬

(石家莊醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 基礎(chǔ)部 生化教研室，河北 石家莊 050071)

目的 利用反向膠束技術(shù)從微紫青霉菌中提取木聚糖酶。方法 采用雙-2-乙基己基硫代琥珀酸鈉(AOT)異辛烷反膠束溶液萃取和反萃取由微紫青霉菌產(chǎn)生的木聚糖酶，探討水相pH值、離子強(qiáng)度、AOT濃度等因素對(duì)分離效率的影響。結(jié)果 當(dāng)AOT濃度為0.6 mol/L，萃取pH 6.0，NaCl濃度為 0.1 mol/L，反萃取 pH 8.0，NaCl濃度為0.5 mol/L，15%乙醇時(shí)，該體系從微紫青霉菌澄清發(fā)酵液中提取木聚糖酶，萃取率接近100%，反萃取率也在80%以上。木聚糖酶酶比活從27 U/mg提高到208 U/mg，提高了6.7倍，且粗酶純化后的比活在200 U/mg以上。結(jié)論 采用此體系提取木聚糖酶具有較好的工業(yè)前景。

木聚糖酶;反膠束;萃取;反萃取;雙-2-乙基己基硫代琥珀酸鈉

木聚糖酶是一類降解木聚糖分子的復(fù)雜酶系，其來(lái)源廣泛，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，本身也是一種多功能酶，其用途廣泛［1］。

分離純化木聚糖酶多采用非特異性方法，如硫酸銨沉淀后，采用離子交換、凝膠色譜分離純化;也有根據(jù)特異性分離的方法，如根據(jù)木聚糖酶能與底物特異性結(jié)合而發(fā)展的親和色譜等［2］，這些方法都存在操作時(shí)間長(zhǎng)，不易放大的缺點(diǎn)［3］。反膠束是表面活性分子在非極性有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的具有熱力學(xué)穩(wěn)定性的納米級(jí)聚集體，其內(nèi)部形成“水池”，可以溶解水和其他親水分子(蛋白質(zhì)等)［4］。反向膠束系統(tǒng)的液液萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)的分離純化方面具有高效、選擇性強(qiáng)和連續(xù)性好的特點(diǎn)［5］。且近期研究表明表面活性劑雙-2-乙基己基硫代琥珀酸鈉(AOT)反向膠束萃取方面具有很大的潛力［6］。采用甘蔗渣渣漿酸水解液作為培養(yǎng)環(huán)境在Palma等［7］的研究中已經(jīng)被提到過(guò)，然而未見(jiàn)后續(xù)報(bào)道。本文嘗試采用反膠束相轉(zhuǎn)移法萃取和反萃取法提取木聚糖酶，探討提取的最優(yōu)條件。

1 材料

微紫青霉菌，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;樺木木聚糖(90%木糖)、AOT(純度 ＞99%)、3，5-二硝基水楊酸，Sigma公司;其余化學(xué)試劑皆為市售分析純。

XW-80A微型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠;TG1650-WS離心機(jī)，上海盧湘儀儀器廠;722分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 微生物與生長(zhǎng)環(huán)境

微紫青霉菌在包含2%葡萄糖、0.25%酵母提取物、2%瓊脂以及基于Vogel's培養(yǎng)基的2%的濃鹽溶液的培養(yǎng)基上30℃連續(xù)培養(yǎng)5 d。菌株所產(chǎn)生的孢子被懸浮于水中，懸浮液通過(guò)置于錐形瓶上的篩絹(200目)進(jìn)行過(guò)濾，獲得孢子濃度為105/mL。

2.2 甘蔗渣渣漿酸水解液的制備

干甘蔗渣800 g與0.25%硫酸溶液8 L混合，將混合液在121℃下高壓蒸煮45 min后將高壓處理過(guò)的水解液過(guò)濾，除去不溶物，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 至 5.5。

2.3 木聚糖酶的制備

培養(yǎng)用培養(yǎng)基由甘蔗渣渣漿水解液以及基于Vogel's培養(yǎng)基的2%的濃鹽溶液和0.1%的酵母提取物構(gòu)成。培養(yǎng)基采用112℃，15 min熱壓消毒，后倒入125 mL錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。每一個(gè)錐形瓶倒入培養(yǎng)基25 mL。培養(yǎng)環(huán)境為:溫度30℃、初始pH 5.5、60 r/min 振蕩培養(yǎng)96 h。

2.4 萃取與反萃取

2.4.1 發(fā)酵液初次酶活測(cè)定 在對(duì)澄清發(fā)酵液實(shí)施萃取與反萃取之前，需對(duì)澄清發(fā)酵液中所包含的木聚糖酶進(jìn)行一次活性的測(cè)定，以此作為確定萃取收率與反萃取收率的參考。

2.4.2 萃取與反萃取 通過(guò)存在于異辛烷中的AOT反向膠束系統(tǒng)，酶被從澄清的發(fā)酵液中提取出來(lái)，整個(gè)過(guò)程包含兩個(gè)步驟。在第一步當(dāng)中，木聚糖酶溶液4 mL與等體積膠束微乳液(AOT反向膠束存在于異辛烷中)進(jìn)行混合，通過(guò)加入磷酸緩沖液調(diào)節(jié)水相的pH。通過(guò)強(qiáng)烈的渦旋5 min，使兩相的分配達(dá)到平衡。離心處理(3 000 r/min，5 min)，使兩相分開(kāi)，測(cè)定水相中酶的活性，計(jì)算萃取收率。第二步則是取包含木聚糖酶的有機(jī)相2 mL與水相(1 mol/L 醋酸緩沖液，pH 5.5，含 0.5 mol/L NaCl)2 mL混合，同時(shí)加入15%的乙醇，渦旋5 min，使之充分混合;通過(guò)離心(3 000 r/min，5 min)最終將酶從膠束中轉(zhuǎn)移到水相中。測(cè)定水相中酶的活性，計(jì)算反萃取收率。

2.4.3 酶活性的測(cè)定 取0.5%樺木木聚糖溶液(用 pH 4.6，50 mmol/L 醋酸緩沖液配制)1 mL，加入酶液0.5 mL，55℃保溫30 min后加入DNS試劑3 mL終止反應(yīng)，然后在沸水浴中煮15 min。冷卻，加水至25 mL，混勻，于550 nm波長(zhǎng)處比色，用煮沸20 min的酶液作對(duì)照。活性單位是在50℃下，每1 min每1 mL酶液水解木糖1μmol所相當(dāng)?shù)拿噶浚?］。

3 結(jié)果和討論

3.1 萃取時(shí)間的影響

利用反向膠束系統(tǒng)從微紫青霉菌發(fā)酵液中提取木聚糖酶的萃取率以及反萃取率與萃取時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)表1。萃取和反萃取均在2 min內(nèi)即可達(dá)到平衡，故本實(shí)驗(yàn)所有的數(shù)據(jù)都是在混合時(shí)間大于2 min的條件下取的，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

表1 渦旋混合時(shí)間的影響

3.2 AOT 的影響

配制不同濃度的AOT反向膠束溶液，對(duì)微紫青霉菌發(fā)酵澄清液進(jìn)行萃取與反萃取。其中反向膠束系統(tǒng) NaCl濃度為0.1 mol/L，pH 為6.0。

從圖1中可以看出，在較低濃度時(shí)，萃取率隨著AOT濃度的增加而迅速提高。可能是因?yàn)樵黾颖砻婊钚詣┑臐舛葧?huì)使反向膠束的聚集數(shù)增加，還能增加反向膠束相整體的極性，從而增加酶蛋白增溶到反向膠束中的機(jī)會(huì)。當(dāng)AOT濃度達(dá)到0.6 mol/L時(shí)，萃取率可達(dá)95%以上。

圖1 AOT濃度對(duì)萃取率的影響萃取(萃取C NaCl=0.1 mol/L，pH 6.0)

當(dāng)AOT濃度超過(guò)0.6 mol/L時(shí)，萃取率變化趨勢(shì)趨于平緩，并且萃取后水相出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可能是因?yàn)楸砻婊钚詣舛认鄬?duì)酶濃度已經(jīng)達(dá)到飽和，通過(guò)增加有機(jī)相中的表面活性劑已經(jīng)不能顯著的改善萃取的效果。并且過(guò)多的表面活性劑會(huì)直接導(dǎo)致其從有機(jī)相中的析出，以至于發(fā)生乳化的現(xiàn)象。因此，實(shí)驗(yàn)選擇的最適表面活性劑AOT濃度為0.6 mol/L。

3.3 水相pH的影響

水相pH值的變化對(duì)萃取率有明顯的影響。如圖2所示，在pH 5.0～6.0的范圍內(nèi)，反向膠束體系對(duì)木聚糖酶有很高的萃取率，都達(dá)到了90%以上。并且隨著pH的降低，萃取率逐漸升高，最高接近100%。pH值對(duì)萃取率的影響主要表現(xiàn)在改變蛋白質(zhì)的表面電荷及其對(duì)構(gòu)象的改變。pH值決定了酶蛋白帶電基團(tuán)的解離速率和所帶的靜電荷。靜電作用是萃取的主要作用力，在pH＜pI時(shí)，酶蛋白帶正電荷，和陰離子表面活性劑極性頭互相吸引。pI和pH的差值越大，靜電作用越強(qiáng)，萃取效果越好。

圖2 萃取水相pH值對(duì)萃取率與反萃取率的影響(C AOT=0.6 mol/L，萃取 C NaCl=0.1 mol/L，反萃取 C NaCl=0.5 mol/L，pH 8.0，乙醇體積分?jǐn)?shù) 15%)

萃取水相pH對(duì)反萃取率的影響見(jiàn)圖2。在pH＞6.0時(shí)，隨pH下降，反萃取率不斷增加，在6.0時(shí)達(dá)到峰值，在pH＜6.0時(shí)，反萃取率反而下降?？赡苁且?yàn)檩腿r(shí)，pH和pI的差值越大，酶和表面活性劑極性頭間的靜電引力就越大，結(jié)合就越牢固，導(dǎo)致在反萃取時(shí)不容易分開(kāi)。

我們注意到pH值在2.9以下時(shí)，有機(jī)相中將出現(xiàn)穩(wěn)定的乳狀物，對(duì)于木聚糖酶的提取將無(wú)法進(jìn)行。另一方面，當(dāng)pH值大于9.8時(shí)酶蛋白將在水相與有機(jī)相的交界處以沉淀的形式析出。對(duì)于以上觀察到的現(xiàn)象我們認(rèn)為，這可以歸因于酶蛋白與表面活性劑形成了復(fù)合結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其變性。

3.4 鹽濃度的影響

圖3顯示了不同鹽濃度對(duì)木聚糖酶萃取率的影響。當(dāng)鹽濃度較低時(shí)，木聚糖酶幾乎全部被萃取;當(dāng)鹽濃度高于一定值時(shí)，萃取率迅速下降，并且在很窄的范圍內(nèi)從100%迅速降到0，所以離子強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的影響相當(dāng)強(qiáng)烈。一個(gè)相對(duì)低的離子強(qiáng)度的條件對(duì)于木聚糖酶的萃取無(wú)疑是有利的，但是離子強(qiáng)度并不是越低越好，在很低的鹽濃度時(shí)，水相乳化嚴(yán)重。并且鹽濃度越高，分相越快越清晰。

圖3 鹽濃度對(duì)萃取率以及反萃取率的影響(C AOT=0.6 mol/L，萃取 pH=6.0，反萃取 pH 8.0，乙醇體積分?jǐn)?shù) 15%)

我們同時(shí)還注意到在反萃取過(guò)程中鹽濃度的變化對(duì)于反萃取率的改變不甚明顯。在這里我們主要考慮的是實(shí)驗(yàn)方案的經(jīng)濟(jì)程度以及反萃取過(guò)程的分相效率問(wèn)題。

3.5 反萃取中乙醇的影響

陳霖杰［9］在對(duì)用AOT/異辛烷反向膠束體系從胰酶粗提物中萃取胰蛋白酶進(jìn)行的研究中指出，通過(guò)在反向膠束相加入乙醇可以解決反向膠束萃取蛋白質(zhì)時(shí)使蛋白質(zhì)變性失活的問(wèn)題，胰蛋白酶的前萃取率達(dá)到90%，反萃取率接近100%。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中注意到如果反萃取時(shí)不加入乙醇，幾乎得不到有活性的酶，加入乙醇，使木聚糖酶的反萃取率得到了明顯的提高。究其原因，可能是因?yàn)橐掖嫉募尤胧沟玫鞍踪|(zhì)和反向膠束內(nèi)表面之間的作用減弱，從而使蛋白質(zhì)更易從反向膠束中遷移出來(lái)，同時(shí)減少酶和表面活性劑極性頭之間強(qiáng)烈的靜電作用而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性。此外，乙醇的加入也使得萃取之后的分相變得更加容易。但過(guò)量乙醇的加入，會(huì)導(dǎo)致反萃取率下降。其原因可能是因?yàn)橐掖几淖兊鞍踪|(zhì)的電荷特性，引起其沉淀析出。根據(jù)圖4結(jié)果，確定乙醇的體積分?jǐn)?shù)為15%。

圖4 反萃取中乙醇對(duì)反萃取率的影響(C AOT=0.6 mol/L，萃取 C NaCl=0.1 mol/L，pH=6.0，反萃取 C NaCl=0.5 mol/L，pH 8.0)

3.6 木聚糖酶初酶的純化

對(duì)于存在于微紫青霉菌澄清發(fā)酵液中的初酶，按照最佳條件:CAOT=0.6 mol/L，萃取 CNaCl=0.1 mol/L，pH 6.0;反萃取 CNaCl=0.5 mol/L，pH 8.0，乙醇體積分?jǐn)?shù)15%，進(jìn)行萃取與反萃取，萃取率為93%，反萃取84%，比活從27 U/mg提高到208 U/mg，提高了6.7倍。一步從微紫青霉菌發(fā)酵液中分離出木聚糖酶，反向膠束技術(shù)取得了較好的效果，為以后進(jìn)一步的精提做好了準(zhǔn)備。

利用該體系提取木聚糖酶還有以下特點(diǎn):一步就可以從粗酶中提取到較純的木聚糖酶，提取時(shí)間短，提取可在室溫下進(jìn)行，AOT廉價(jià)易得，有機(jī)溶劑可循環(huán)使用。本體系的粗酶來(lái)源簡(jiǎn)單，產(chǎn)量豐富，所運(yùn)用的培養(yǎng)基方便易得且經(jīng)濟(jì)成本相對(duì)低廉，可以為工業(yè)生產(chǎn)提供良好的基礎(chǔ)。

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Extracting xylanase from Penicillium janthinellum using AOT-reverse micellar systems

REN Jing
(Biochemical Department of Shijiazhuang Medical College，Shijiazhuang 050071，China)

TQ464.8

A

1005-1678(2012)02-0167-03

2011-11-21

任 敬，女，本科，助教，研究方向:生化教學(xué)。