蔣賢忠，趙競(jìng)，金可可，李劍敏，趙晨晨，曾玉萍，樓帥，邱曉曉

（溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035，1.第一臨床醫(yī)學(xué)院；2.病理生理學(xué)教研室）

糖尿病心肌病（diabetes cardiomyopathy， DC）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，可發(fā)展為心力衰竭，是導(dǎo)致DM患者死亡的主要原因。研究表明，細(xì)胞凋亡參與了DC的發(fā)生、發(fā)展[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）能有效逆轉(zhuǎn)DC心臟重構(gòu)，具有明顯的心肌保護(hù)作用[2]，但其在DC細(xì)胞凋亡方面的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）建立DM大鼠模型，觀察ACEI類藥物卡托普利（captopril）對(duì)DM心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙2010-0150）。

1.2 主要試劑 卡托普利（規(guī)格：25 mg/片）購(gòu)自常州制藥廠；STZ及枸櫞酸鈉分析純購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；BeyoECL Plus（免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑盒）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立 健康SPF級(jí)成年雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分成正常對(duì)照組（NC組）10只和造模組20只。造模組大鼠禁食12 h后，STZ按65 mg/kg劑量腹腔注射，注射后72 h測(cè)血糖在13.8 mmol/L以上者為造模成功。NC組則給予等容積的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。成功模型大鼠隨機(jī)分為DM組、卡托普利組（Cap組）。Cap組按50 mg/（kg·d）劑量灌胃給予卡托普利，DM組和NC組則給予等容積的0.9%氯化鈉溶液。所有動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)，每2周測(cè)血葡萄糖一次。飼養(yǎng)12周后行股動(dòng)脈放血處死大鼠。

1.4 大鼠生長(zhǎng)過(guò)程相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 大鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量監(jiān)測(cè)。

1.5 大鼠血糖水平的測(cè)定 每隔2周行斷尾采血法（采用Johnson穩(wěn)步倍加血糖儀）測(cè)定大鼠血糖一次，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠血糖水平的變化。

1.6 原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡 按試劑盒說(shuō)明書操作。顯微鏡下細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即心肌組織凋亡細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)算5個(gè)高倍視野（×400）下的凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）以凋亡細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞（%）表示。

1.7 Western blot法檢測(cè)心臟組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá) 大鼠處死后立即取出心臟，冰浴上取左心室前壁組織，將所取組織于-70 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，每組各3只。全細(xì)胞裂解液提取心臟組織總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h后ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值，以GADPH為內(nèi)參照進(jìn)行蛋白半定量。

1.8 心臟組織超微結(jié)構(gòu)觀察 取左心室前壁1 mm×1 mm×1 mm大小的組織2～3塊，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇丙酮系列梯度脫水后Epon812包埋，超薄切片，醋酸硝酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，用±s表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’s T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 NC組大鼠精神活躍，動(dòng)作自如，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)平伏有光澤，生長(zhǎng)速度較快；DM組大鼠出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿癥狀，精神萎靡，動(dòng)作遲緩，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)無(wú)光澤，弓背蜷體，體質(zhì)量較NC組明顯減輕；Cap組較DM組多飲、多食、多尿癥狀減輕，精神較活躍，活動(dòng)度較好，毛發(fā)較有光澤，體質(zhì)量減輕情況改善。三組大鼠12周的體質(zhì)量變化見(jiàn)圖1。

2.2 血糖水平的變化 NC組大鼠血糖正常，很穩(wěn)定；與NC組相比，DM組、Cap組大鼠血糖顯著升高（均P<0.05）；與DM組比較，Cap組大鼠血糖升高幅度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 心臟組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) NC組少量細(xì)胞凋亡；DM組細(xì)胞凋亡較NC組明顯增加（P<0.05）；Cap組細(xì)胞凋亡較DM組明顯減少，但仍高于NC組（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1、圖3。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化曲線

圖2 三組大鼠血糖的變化曲線

表1 各組大鼠心臟組織細(xì)胞AI、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白比較（n=10±s）

表1 各組大鼠心臟組織細(xì)胞AI、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白比較（n=10±s）

與NC組比：aP<0.05；與DM組比：bP<0.05

Bcl-2 0.880±0.156 0.613±0.032a 0.900±0.046b組別NC DM Cap AI(%)1.93±0.60 30.62±2.05a 23.45±1.70ab Bax 0.683±0.038 1.177±0.112a 0.817±0.064b Caspase-3 0.297±0.085 0.930±0.168a 0.433±0.205b

2.4 Western blot法檢測(cè)心臟組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá) 與NC組相比，DM組心臟組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加（均P<0.05）；與DM組相比，Cap組心臟組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯減少（均P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1、圖4-6。

2.5 心臟組織超微結(jié)構(gòu)改變 NC組心肌肌原纖維豐富，肌絲分布均勻；線粒體膜完整，嵴排列規(guī)則；微血管基底膜連續(xù)完整。DM組心肌細(xì)胞腫脹，肌原纖維灶性溶解，肌絲排列紊亂，部分?jǐn)嗔?；線粒體腫脹，嵴排列紊亂甚至斷裂，空泡形成；間質(zhì)膠原增生，微血管基底膜增厚。Cap組心肌肌原纖維部分排列紊亂；線粒體腫脹減輕，少部分嵴斷裂；微血管基底膜增厚減輕。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖4 Western blot法檢測(cè)各組大鼠心臟組織Bcl-2蛋白的表達(dá)

圖5 Western blot法檢測(cè)各組大鼠心臟組織Bax蛋白的表達(dá)

圖6 Western blot法檢測(cè)各組大鼠心臟組織Caspase-3蛋白的表達(dá)

圖7 各組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化（電鏡，×10000）

3 討論

DC是指DM患者心肌原發(fā)性損傷引起廣泛的結(jié)構(gòu)異常，最終引起左心室肥厚，舒張期和（或）收縮期功能障礙的一種疾病狀態(tài)，由Rubler于1972年最早提出。但迄今為止，其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，可能機(jī)制包括心肌細(xì)胞代謝紊亂、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、間質(zhì)纖維化、心臟自主神經(jīng)病變等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡參與DC的發(fā)生和發(fā)展，長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控及一系列蛋白酶形成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程[1]。

Bcl-2基因家族是主要的凋亡調(diào)控蛋白，Bcl-2是首個(gè)被確認(rèn)有抑制凋亡作用的基因，其抗凋亡的機(jī)制主要是：①直接抗氧化作用；②維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)；③抑制Caspases的激活；④抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的釋放；⑤抑制促凋亡蛋白Bax、Bak的細(xì)胞毒作用。Bax亦為Bcl-2基因家族成員，含有與Bcl-2基因一致的BH1、BH2、BH3三個(gè)同源區(qū)域，但其作用與Bcl-2基因相反，屬于促凋亡基因。Bcl-2高表達(dá)時(shí)，可形成Bcl-2/Bcl-2同源二聚體，也可形成Bcl-2/Bax異源二聚體，均抑制凋亡；Bax高表達(dá)時(shí)，則形成Bax/Bax同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。Caspase家族是參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行凋亡最重要的蛋白酶之一，Caspase-3作為Caspase家族中最重要的成員，是凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，控制著細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展。劉欣等[5]研究顯示，DM時(shí)心肌細(xì)胞凋亡增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)增加。Cai等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高血糖導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡至少部分是通過(guò)Caspase-3依賴性的線粒體途徑調(diào)控的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DM組大鼠心肌細(xì)胞AI明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)增加，電鏡示心肌超微結(jié)構(gòu)呈明顯損傷性變化，說(shuō)明DC時(shí)細(xì)胞凋亡的發(fā)生與Bcl-2、Bax表達(dá)水平的異常改變及Caspase-3的激活有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)所致的Caspase-3依賴性的細(xì)胞凋亡可能是DC的發(fā)生機(jī)制之一。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，心肌局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS）的過(guò)度激活，血管緊張素II（AngII）的異常作用也參與DC細(xì)胞凋亡的過(guò)程[7]。卡托普利是ACEI類藥，可通過(guò)抑制全身或局部的RAS，減少AngII的生物合成而具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[8]。本實(shí)驗(yàn)觀察到Cap組心肌AI明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)減少，超微結(jié)構(gòu)損傷不同程度減輕，表明卡托普利可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，減少Caspase-3依賴性的心肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)DM心肌結(jié)構(gòu)。

綜上所述，卡托普利可以改善DM大鼠高血糖、體質(zhì)量減輕等癥狀及心肌結(jié)構(gòu)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，減少Caspase-3依賴性的心肌細(xì)胞凋亡，為臨床干預(yù)DC的發(fā)生、發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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