潘曉燕，龔小花，楊麗娟，沈飛霞

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325000）

近年來，2型糖尿病的發(fā)病率明顯增加，其危害性主要表現(xiàn)在慢性并發(fā)癥導(dǎo)致的高致死率、高致殘率[1]。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是其典型的微血管并發(fā)癥之一。研究表明，由DN造成的腎功能衰竭比非糖尿病患者高17倍，是糖尿病患者主要死亡原因之一，因此DN的防治工作關(guān)系重大。

近年有研究證實(shí)炎癥遞質(zhì)在DN病理發(fā)展中扮演著重要角色。白細(xì)胞介素18（IL-18）是IL-1細(xì)胞因子家族的成員，主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其他組織細(xì)胞也廣泛表達(dá)，在免疫調(diào)節(jié)以及多種免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中都起著重要作用[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)，早期DN患者血漿IL-18顯著升高，且高水平IL-18能加重DN動物模型腎功能的衰竭，這提示IL-18很可能是啟動DN患者腎功能走向衰竭的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[3-6]。DN腎組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）高表達(dá)是DN腎功能惡化的經(jīng)典途徑之一。然而，DN腎組織中TGF-β1升高的原因仍不完全清楚。研究表明IL-18能通過與IL-18受體的結(jié)合激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)TH1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子。在此基礎(chǔ)上，本研究以IL-18作為DN抗感染治療的靶點(diǎn)，選擇腎小球系膜細(xì)胞（mesangial cells，MCs）作為研究的靶細(xì)胞進(jìn)行研究，觀察高糖環(huán)境下IL-18和TGF-β1的表達(dá)及兩者的相互關(guān)系，并阻斷IL-18觀察TGF-β1的表達(dá)變化。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠腎小球系膜細(xì)胞系（HBZY-1，中國典型培養(yǎng)物保藏中心），葡萄糖（Sigma），IL-18抗體（Santa cruz），TGF-β1抗體（Abcam），二抗（CST），倒置顯微鏡（Leica），熒光定量PCR儀（Roche 480）。

1.2 方法 腎小球系膜細(xì)胞加入ATCC完全生長培養(yǎng)液（含3×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素及10%滅活小牛血清），置于37 ℃、5% CO2濃度、體積分?jǐn)?shù)為0.05的飽和濕度培養(yǎng)箱中，每日換液1次，3～4 d傳代1次。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：取對數(shù)生長期的系膜細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)：①正常糖組（NG組）: ATCC培養(yǎng)液中加入葡萄糖（終濃度5.5 mmol/L）；②高糖組（HG組）：在培養(yǎng)液中加入葡萄糖（終濃度25 mmol/L）；③IL-18正常糖組（IL-18/NG組）：在培養(yǎng)液中分別加入四個不同濃度IL-18[1 ng/dL（IL-18/NG-1組）、10 ng/dL（IL-18/NG-2組）、50 ng/dL（IL-18/NG-3組）、100 ng/dL（IL-18/NG-4組）]+葡萄糖濃度5.5 mmol/L；Con/NG-O組培養(yǎng)液中未加入IL-18，作為對照組。④IL-18高糖組（IL-18/HG組）：在培養(yǎng)液中分別加入四個不同濃度IL-18[1 ng/dL（IL-18/HG-1組）、10 ng/dL（IL-18/HG-2組）、50 ng/dL（IL-18/HG-3組）、100 ng/dL（IL-18/HG-4組）]+高糖（25 mmol/L）；Con/HG-O組培養(yǎng)液中未加入IL-18，作為對照組。⑤IL-18抗體-正常糖組（IL-18Ab/NG組）：在培養(yǎng)液中加入IL-18 Ab 100 g/dL+葡萄糖濃度5.5 mmol/L；⑥IL-18抗體-高糖組（IL-18Ab/HG組）：在培養(yǎng)液中加入IL-18 Ab 100 g/dL+葡萄糖濃度25 mmol/L。通過IL-18抗體拮抗IL-18來阻斷TGF-β1的表達(dá)。系膜細(xì)胞以每孔2×105個細(xì)胞數(shù)接種到6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個復(fù)孔（n=3）。

1.2.2 熒光定量PCR檢測IL-18和TGF-β1 mRNA的表達(dá)：每孔棄培養(yǎng)液，按說明書Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用Oligo（dT）18進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。按照說明書使用膠回收法純化DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)品。用SYBR Green I熒光嵌合法在Rea1-time的PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR檢測。選取β-actin為內(nèi)參照。引物序列如下β-actin：上游5’-GTAAAGACCTCTATGC CAACA-3’，下游5’-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3’；IL-18：上游5’-CAACCGCAGTAATACGGAGCAT-3’，下游5’-TCTGGGATTCGTTGGCTGTT-3’；TGF-β1：上游5’-ACCTTGG TAACCGGCTGC-3’，下游5’- TCCTTGGTTCAGCCACTGC-3’。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min；然后進(jìn)行94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán);最后72 ℃延長7 min，2次，在延伸的過程中收集熒光信號，擴(kuò)增結(jié)束后收集溶解曲線。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。IL-18 mRNA相對表達(dá)量/β-actin mRNA相對表達(dá)量和TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量/β-actinm RNA相對表達(dá)量分別為為IL-18和TGF-β1的mRNA表達(dá)量校正值。每個樣本均設(shè)3個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組數(shù)據(jù)均以±s表示。多組間差異比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較方差齊者采用SNK法，方差不齊者采用Games-Howell法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖對IL-18、TGF-β1水平的影響 IL-18 mRNA表達(dá)量NG組為1.06±0.47，HG組為8.75±0.34；TGF-β1 mRNA表達(dá)量NG組為1.03±0.31，HG組為7.23±1.18，與NG組比較，HG組IL-18、TGF-β1 mRNA表達(dá)均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 TGF-β1 mRNA在不同濃度IL-18條件下的表達(dá)（±s）

表1 TGF-β1 mRNA在不同濃度IL-18條件下的表達(dá)（±s）

與Con/NG-O組、Con/HG-O組比：aP＜0.05；bP＜0.01；HG同濃度各組與NG各組比：cP＜0.01

分組IL-18的濃度IL-18/NG組0 1 1 0 50 100 IL-18/HG組Con/NG-0組IL-18/NG-1組IL-18/NG-2組IL-18/NG-3組IL-18/NG-4組Con/HG-0組IL-18/HG-1組IL-18/HG-2組IL-18/HG-3組IL-18/HG-4組0 1 1 0 50 100 TGF-β1 mRNA 表達(dá)量1.01±0.18 1.39±0.04a 1.55±0.15a 2.06±0.05b 2.93±0.29b 4.36±0.50 6.67±0.20bc 8.87±0.44bc 9.91±0.79bc 9.84±0.57bc

2.2 IL-18對TGF-β1水平的影響 相同濃度IL-18條件下，IL-18/HG組TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平均高于IL-18/NG組；TGF-β1 mRNA表達(dá)隨IL-18濃度增高而增加。TGF-β1表達(dá)升高依賴于IL-18，且有劑量依賴性。具體見表1。

2.3 IL-18對TGF-β1水平的影響 在NG組和HG組，分別加入100μg/dL的IL-18 Ab，結(jié)果表明在髙糖情況下通過IL-18抗體拮抗IL-18可抑制TGF-β1的表達(dá)（P＜0.01）。具體見表2。

表2 TGF-β1 mRNA在阻斷IL-18后的表達(dá)（±s）

表2 TGF-β1 mRNA在阻斷IL-18后的表達(dá)（±s）

與NG組比：aP＜0.01；與HG組比：bP＜0.01

分組 藥物和濃度TGF-β1 mRNA的表達(dá)量

3 討論

DN的發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚，除傳統(tǒng)的代謝和血流動力學(xué)因素對腎臟的損傷外，目前認(rèn)為免疫和炎癥遞質(zhì)在DN病理發(fā)展中扮演著重要角色[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)，早期DN患者血漿IL-18顯著升高，且高水平IL-18能加重DN動物模型腎功能的衰竭，這提示IL-18很可能是啟動DN腎功能走向衰竭的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本研究以大鼠腎小球系膜細(xì)胞為對象，研究高糖環(huán)境下IL-18與TGF-β1表達(dá)及其相互關(guān)系，探討IL-18在DN腎功能衰竭疾病機(jī)制中的作用及意義。

IL-18是IL-1細(xì)胞因子家族的成員，它的結(jié)構(gòu)與IL-1β相似，但它在炎癥和免疫調(diào)節(jié)過程中具有不同于IL-1β的特性[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，DN患者血和尿IL-18水平升高，且高水平IL-18與低腎臟功能顯著相關(guān)；此外，糖尿病患者即使在正常尿蛋白期，其IL-18濃度較對照組亦明顯升高，且高水平IL-18與腎小球?yàn)V過率下降顯著相關(guān)[3-6]；動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，每日注射IL-18，使非糖尿病動物體內(nèi)IL-18升高，其尿蛋白排泄率顯著升高，而預(yù)先注射IL-18保護(hù)性抗體，IL-18升高尿蛋白排泄率的作用消失[8]。由此可見，IL-18在早期DN患者體內(nèi)顯著升高，且IL-18很可能是啟動DN腎功能走向衰竭的早期關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)高糖可以導(dǎo)致IL-18和炎癥因子TGF-β1表達(dá)升高，證實(shí)了IL-18與高糖導(dǎo)致的腎小球系膜細(xì)胞炎癥及損傷有關(guān)，但是IL-18是作為調(diào)節(jié)因子還是效應(yīng)因子發(fā)揮作用，目前仍不清楚，探討其具體的作用機(jī)制有助于進(jìn)一步了解DN炎癥持續(xù)的免疫學(xué)機(jī)制，為尋找新的治療策略帶來新的思路。

DN的病理改變是腎小球細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性積聚，基底膜增厚，濾過面積減少，腎小球進(jìn)行性纖維化，最終可導(dǎo)致終末期腎病。DN腎組織中TGF-β1高表達(dá)是DN腎功能惡化的經(jīng)典途徑之一。TGF-β1刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成，誘使MCs的硬化，加速血漿蛋白從腎小球基底膜漏出到包氏囊，誘導(dǎo)下游腎小管區(qū)域促炎和促纖維化的損傷，從而介導(dǎo)腎小管的纖維化和萎縮[9]。然而，DN腎組織中TGF-β1升高的原因仍不完全清楚。既往研究表明，血流動力學(xué)因素、高糖環(huán)境、糖基化終末產(chǎn)物、糖基化終末產(chǎn)物受體上調(diào)是DN腎組織TGF-β1表達(dá)增加的重要原因，但是，糾正DN患者血液循環(huán)及降低血糖并不能有效降低DN腎組織TGF-β1表達(dá)，亦不能阻止DN的進(jìn)一步惡化。因此高糖并不是導(dǎo)致TGF-β1表達(dá)增高的直接原因。本研究建立在大鼠系膜細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，觀察高糖對系膜細(xì)胞的IL-18和TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，高糖條件下不僅IL-18、TGF-β1表達(dá)均升高，并且TGF-β1表達(dá)升高依賴于IL-18的升高，兩者存在劑量依賴性；通過IL-18 Ab阻斷IL-18發(fā)現(xiàn)可以抑制TGF-β1的表達(dá)。由此我們推測在HBZY-1中，IL-18可以發(fā)揮調(diào)節(jié)因子作用，是TGF-β1的上游調(diào)控因子，對上調(diào)TGF-β1的表達(dá)有重要作用。因此通過IL-18抗體拮抗IL-18來阻斷TGF-β1的表達(dá)，可以防止或減少DN炎癥啟動，進(jìn)而有助于阻止DN的發(fā)生，是防治DN的有意義的新靶點(diǎn)。目前已有研究表明IL-18能通過與IL-18受體的結(jié)合激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)TH1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子；基于此研究結(jié)果，本課題組將繼續(xù)對IL-18與TGF-β1的信號通路及胞內(nèi)途徑及其蛋白表達(dá)作進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究顯示高糖可以導(dǎo)致IL-18表達(dá)升高，IL-18可以誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1高表達(dá)，啟動DN腎臟炎癥。該結(jié)果進(jìn)一步闡明了DN炎癥啟動及進(jìn)展的免疫學(xué)機(jī)制，為IL-18抗體治療DN提供理論依據(jù)，為DN防治策略提供新的思路。

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