嵇曉利，劉勁松，徐海紅，劉傳通，張大風(fēng)，麻健豐

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔修復(fù)科，浙江 溫州 325027）

近年來(lái)，基因治療在骨組織工程中受到越來(lái)越多的關(guān)注?；蛑委煹年P(guān)鍵在于如何借助載體將外源基因準(zhǔn)確有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞。基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但存在自身難以克服的局限性，如能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)及潛在的致癌性，制備復(fù)雜等。而非病毒載體具有安全性高，免疫原性低，易于組裝，體內(nèi)可反復(fù)應(yīng)用等優(yōu)勢(shì)，使其在組織工程中應(yīng)用逐漸增多。陽(yáng)離子聚合物如聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）、多聚賴(lài)氨酸、陽(yáng)離子脂質(zhì)體等是目前應(yīng)用最多的非病毒載體類(lèi)型。1995年Boussif等[1]首次使用PEI作為非病毒載體將DNA有效地轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元細(xì)胞。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，PEI可縮合質(zhì)粒DNA，具有特殊的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，不需溶酶體抑制劑即可轉(zhuǎn)染細(xì)胞。PEI被認(rèn)為是目前最為有效的非病毒載體之一[2-3]。PEI介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率受多方面因素影響，其中N/P值（PEI與DNA的氮磷比，即PEI的氨基與DNA的磷酸基團(tuán)的摩爾比例）對(duì)其影響最大[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)考察PEI與含骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7基因（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）質(zhì)粒形成的納米復(fù)合物N/P值對(duì)復(fù)合物轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，MSC）表達(dá)BMP-7以及細(xì)胞毒性的影響，從而篩選出較優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件，為PEI作為非病毒載體在骨組織工程中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料及儀器 pcDNA3.1-BMP-7質(zhì)粒（由四川大學(xué)蔣嬡醫(yī)師惠贈(zèng)）；大腸桿菌；出生1周SD大鼠；PEI分子量為25 kD，分枝型（Sigma，美國(guó)）；質(zhì)粒大量抽提試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)）；ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；粒徑/Zeta電位測(cè)定儀（Malvern，英國(guó)）。

1.2 PEI/DNA復(fù)合物的制備 BMP-7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌并按照質(zhì)粒DNA的提取試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行pcDNA3.1-BMP-7質(zhì)粒的大量擴(kuò)增。精密稱(chēng)取適量PEI溶于PBS（pH 7.4，150 mmol/L），制得1 mg/mL的儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液稀釋成0.1 mg/mL的PEI試液，并與質(zhì)粒溶液（0.1 mg/mL）按一定的N/P值（0.5、1、3、5、7、10、20和30）輕搖混合，靜止30 min備用。

1.3 PEI/DNA復(fù)合物粒徑及Zeta電位測(cè)定 采用粒徑/Zeta電位測(cè)定儀測(cè)定已經(jīng)制備的納米復(fù)合物的粒徑以及Zeta電位值。

1.4 DNA酶（DNase）保護(hù)實(shí)驗(yàn) DNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)復(fù)合物抵御DNase消化的能力。按不同的N/P值制備PEI/DNA復(fù)合物，每份20μL，分裝于離心管。每管加入4單位的DNA酶1（DNase1）或4μL PBS（對(duì)照），37 ℃反應(yīng)15 min（1單位DNasel的活性指在37 ℃，用時(shí)10 min完全消化1 mg DNA所需要的酶量）。反應(yīng)后，馬上加入100 mmol EDTA，室溫靜置10 min以滅活酶活性。進(jìn)一步把每份樣品加入肝素鈉溶液（10μL，10μg/mL）或H2O，室溫下靜置2 h，以釋放DNA。重復(fù)檢測(cè)3次，最后通過(guò)凝膠電泳分析PEI對(duì)DNA的保護(hù)效果。

1.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將第三代MSC細(xì)胞接種于96孔板，密度5000個(gè)/孔，每孔0.2 mL a-MEM培養(yǎng)基，隨后把96孔板置于37 ℃、5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育24 h使細(xì)胞重新貼壁生長(zhǎng)。然后將96孔板中的培養(yǎng)基移除，每孔加入100μL無(wú)血清培養(yǎng)基，除了其中3個(gè)對(duì)照孔外，其余實(shí)驗(yàn)孔加入濃度為7μg/mL的不同N/P值（0.5、1、3、5、7、10、20和30）的PEI/DNA復(fù)合物，每N/P值實(shí)驗(yàn)組5個(gè)實(shí)驗(yàn)孔。再將96孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸取培養(yǎng)液每孔加入100μL內(nèi)含5μg/mL MTT的a-MEM，37 ℃溫育4 h。翻板法棄去液體。每孔加入100μL二甲基亞砜，震蕩10 min，立即于微孔板閱讀器上，在490 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值（optical density，OD）均值。以陰性對(duì)照組OD值為100%細(xì)胞增殖率，計(jì)算各組細(xì)胞相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR=（各濃度組OD均值/陰性對(duì)照組OD均值）×100%。

1.6 轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 取第三代的MSCs，以5×103/mL的濃度接種于96孔板中，每孔液量1 mL。待細(xì)胞貼壁鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板達(dá)60%～70%后，分別加入濃度為7 mg/mL的不同N/P值（0.5、1、3、5、7、10、20和30）PEI/DNA復(fù)合物，每N/P值實(shí)驗(yàn)組5個(gè)實(shí)驗(yàn)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去除24孔板中的培養(yǎng)基，PBS沖洗孔板，加入細(xì)胞裂解液，取裂解后樣品離心，取上清液，4 ℃保存。按照ELISA試劑盒的步驟測(cè)定BMP-7的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEI/DNA復(fù)合物的粒徑和Zeta電位 復(fù)合物的N/P值從0.5上升到3時(shí)，粒徑隨PEI的增加而減?。≒<0.05）。而N/P值在3～30的范圍時(shí)，復(fù)合物的粒徑相對(duì)較穩(wěn)定（P>0.05）。N/P值從0.5上升到5時(shí)，復(fù)合物的Zeta電位從2.10 mV升至31.85 mV。N/P值在5～30范圍時(shí)，Zeta電位在30～40 mV波動(dòng)（見(jiàn)表1）。

2.2 復(fù)合物抵御DNase消化的能力 圖1為加入DNase后電泳結(jié)果。在N/P值低于3時(shí)，泳道中正極方向完全沒(méi)有DNA的亮色條帶出現(xiàn)，說(shuō)明DNA已經(jīng)被DNase完全分解；當(dāng)N/P值在3至30時(shí)，隨著PEI的增加，DNA亮色條帶出現(xiàn)并逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明PEI對(duì)DNA的保護(hù)功能增強(qiáng)。

表1 不同N/P比形成的PEI/DNA納米顆粒的平均直徑、Zeta電位、MSC的BMP-7表達(dá)量

圖1 DNase 1處理后凝膠電泳（電泳圖上方為N/P值）

2.3 復(fù)合物對(duì)MSC的轉(zhuǎn)染效率及毒性 N/P值對(duì)MSC活力的影響見(jiàn)圖2。當(dāng)N/P值越小時(shí)，即DNA比例越高時(shí)，對(duì)MSC毒性越小。當(dāng)N/P值在0.5～10范圍內(nèi)，細(xì)胞活力有下降，但相對(duì)較?。≒>0.05）。當(dāng)N/P值高于10時(shí)，細(xì)胞活力下降明顯，細(xì)胞毒性增大（P<0.05）。不同N/P值的復(fù)合物轉(zhuǎn)染MSC的BMP-7蛋白質(zhì)表達(dá)量見(jiàn)表1。其轉(zhuǎn)染效率在0.5～7范圍時(shí)，隨著N/P值的增加，MSC的BMP-7表達(dá)量隨之增加（P<0.05），在N/P=7時(shí)達(dá)到峰值，其后隨著N/P值增加，BMP-7表達(dá)量反而下降（P<0.05）。

圖2 N/P值對(duì)MSC活力的影響

3 討論

BMP-7是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族的一員，其基因位于人的第20號(hào)染色體，分子質(zhì)量約1.6 kb。BMP-7在單獨(dú)存在的情況下即可誘導(dǎo)軟骨和骨組織的形成。實(shí)驗(yàn)證明，重組人BMP-7在體內(nèi)和體外都顯示了高效的骨誘導(dǎo)活性，可使多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的骨缺損愈合[5-6]。它可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶的表達(dá)，促進(jìn)MSC增殖，并促使其向成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)體外成骨，被認(rèn)為具有較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力，已廣泛用于骨組織工程學(xué)[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇含BMP-7基因的質(zhì)粒pcDNA3.1作為緩釋基因，為今后基因緩釋組織工程支架材料方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

分枝型PEI及其衍生物類(lèi)基因傳遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染效率和它們的毒性取決于其分子量、陽(yáng)離子電荷密度和它們的緩沖能力[8-9]，分枝型PEI的基因轉(zhuǎn)染效率隨分子量增大而提高，但分子量大時(shí)其細(xì)胞毒性也隨之增加，25 kD分枝型PEI是其轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性的最佳平衡點(diǎn)，是迄今發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)染效率最高的非病毒載體之一[10]。本實(shí)驗(yàn)選此種材料作為基因載體。

PEI/DNA復(fù)合物的表面電荷、粒徑是其體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的重要影響因素。復(fù)合物粒徑大小與PEI的分子量有關(guān)，分子量大對(duì)DNA壓縮能力強(qiáng)，粒徑小。本實(shí)驗(yàn)顯示PEI與含BMP-7基因的質(zhì)粒形成的納米顆粒直徑在80～200 nm，這與大多數(shù)文獻(xiàn)[11-12]用于體內(nèi)外轉(zhuǎn)染的復(fù)合物的粒徑范圍相似。隨著復(fù)合物N/P值的增加，粒徑有減小的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著PEI量的增加，其對(duì)DNA的壓縮能力增強(qiáng)，有利于細(xì)胞的吞噬及體內(nèi)逃脫。PEI/DNA復(fù)合物表面帶有的正電荷是與表面帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞或胞飲的前提條件，但Zeta電位過(guò)高的復(fù)合物不僅毒性大，而且由于容易結(jié)合蛋白質(zhì)（主要是白蛋白）或紅細(xì)胞，復(fù)合物在體內(nèi)較快清除。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)復(fù)合物的N/P值范圍在5～30時(shí)，Zeta電位相對(duì)穩(wěn)定，有利于復(fù)合物細(xì)胞膜結(jié)合繼而進(jìn)入胞內(nèi)，對(duì)BMP-7的蛋白質(zhì)表達(dá)量的檢測(cè)也證實(shí)最佳轉(zhuǎn)染效率在此N/P值范圍內(nèi)出現(xiàn)。轉(zhuǎn)染效率是檢測(cè)基因治療效果最重要的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)BMP-7的蛋白質(zhì)表達(dá)量來(lái)測(cè)定[13]。轉(zhuǎn)染復(fù)合物N/P值對(duì)其轉(zhuǎn)染效率有極大的影響，在生理pH條件下PEI中的1/5～1/6胺基被質(zhì)子化[14]，并且這些帶正電荷的胺基將與DNA中的負(fù)電荷結(jié)合形成納米膠體顆粒。當(dāng)N/P高時(shí)，即復(fù)合物的凈的正電荷增加時(shí)，復(fù)合物與細(xì)胞的相互作用加強(qiáng)并且增加了細(xì)胞與細(xì)胞核的吸收能力[15-16]。從結(jié)果可以看出，N/P值對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響呈現(xiàn)雙向效應(yīng)。在N/P值低于7時(shí)，轉(zhuǎn)染效率隨N/P值增加而增加。這是由于隨著PEI的增加，DNA被充分壓縮包裝，更有利于細(xì)胞跨越細(xì)胞膜障礙。而過(guò)高的N/P值反而會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的下降，可能與DNA過(guò)度壓縮顆粒過(guò)小有關(guān)。

PEI的細(xì)胞毒性可能是由于其對(duì)細(xì)胞膜有較高的親合黏附，并且能穿透細(xì)胞壁。PEI在細(xì)胞膜上可形成2～6 mm的團(tuán)狀物，低分子量的PEI形成僅10～50 nm的小聚集物，但當(dāng)PEI與DNA結(jié)合后，毒性作用減弱[17]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)單純PEI的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于PEI/DNA復(fù)合物的毒性。其可能的原因是含陽(yáng)離子的聚合物與含有陰離子的DNA結(jié)合后，PEI的陽(yáng)離子與細(xì)胞膜的相互作用減弱而細(xì)胞產(chǎn)生損傷減少。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，當(dāng)N/P值大于10 時(shí)，細(xì)胞的毒性急劇增加，與其他研究[18]結(jié)果相近。

通過(guò)以上一系列檢測(cè)，我們認(rèn)為應(yīng)盡量選擇對(duì)細(xì)胞毒性小而轉(zhuǎn)染效率高的參數(shù)。因此在組織工程應(yīng)用中，N/P值為7～10的PEI/DNA復(fù)合物可獲得對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞較好的轉(zhuǎn)染效果。

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