宋文軍，王雪青，付秀娟

（a.天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；b.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

固定化培養(yǎng)對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)及其提取物的抑菌效果影響研究

宋文軍，王雪青，付秀娟

（a.天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；b.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

分別選用液體懸浮培養(yǎng)、海藻酸鈣固定培養(yǎng)和海藻酸鈉－殼聚糖－海藻酸鈉（Alginate－chitosan－alginate，ACA）微膠囊法對(duì)球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）進(jìn)行培養(yǎng)，考察不同培養(yǎng)方法對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響以及藻細(xì)胞經(jīng)磷酸緩沖液、體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液、甲醇與甲苯的混合液（體積比為3∶1）、乙酸乙酯、丙酮5種溶劑提取的提取物對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌（Escherichiacoli）的抑菌活性.結(jié)果表明，ACA微膠囊法培養(yǎng)的藻細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，提取物中抑菌物質(zhì)含量高，抑菌效果最好.

固定化；海藻酸鈣；ACA微膠囊；球等鞭金藻；抑菌

微藻中富含大量蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，粗蛋白含量超過(guò)60%，生物學(xué)產(chǎn)量高于任何作物，已被應(yīng)用到嬰兒食品、老年保健食品及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品中.由于微藻種類多、數(shù)量大、處于海洋食物鏈的基礎(chǔ)，因此也是篩選抗腫瘤藥物的庫(kù)源［1］，其提取物在抑菌方面的作用已有報(bào)道［2－4］.

球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）是一種分布廣泛的海洋浮游單細(xì)胞藻類，屬于金藻門，金藻綱，等鞭金藻目，等鞭金藻科，等鞭金藻屬.經(jīng)常作為海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)雙殼動(dòng)物幼蟲良好的基礎(chǔ)餌料［5］，對(duì)某些海產(chǎn)動(dòng)物幼蟲飼養(yǎng)效果非常好［6－7］.球等鞭金藻在生長(zhǎng)過(guò)程中能合成多種生物活性物質(zhì)，如葉綠素a、葉綠素c、β－胡蘿卜素和葉黃素等色素以及多糖及不飽和脂肪酸等，尤其是細(xì)胞內(nèi)EPA和DHA等多不飽和脂肪酸的含量較高［8－9］.研究組從大量的海洋微藻中篩出了對(duì)腫瘤細(xì)胞系He La，B16－F10有明顯毒活性的微藻株：球等鞭金藻H29（Isochrysisgalbana29），該藻的甲醇和甲苯混合萃取物對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌效果，故頗具開發(fā)的潛力.但此藻個(gè)體微小，所用培養(yǎng)基鹽度大，不利于離心或過(guò)濾收集，而固定化培養(yǎng)有利于解決這一問(wèn)題.

目前藻類固定化培養(yǎng)的主要方法分為載體法、吸附法、包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法和交聯(lián)法等.該研究以懸浮培養(yǎng)為對(duì)照，通過(guò)海藻酸鈣包埋法［10］和海藻酸鈉－殼聚糖－海藻酸鈉（Alginate－chitosan－alginate，ACA）液芯包囊法［11］對(duì)球等鞭金藻H29進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，并且測(cè)定不同培養(yǎng)方法所得藻類提取物的抑菌活性.

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

殼聚糖（購(gòu)自上?？ú┕べQ(mào)有限公司，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改性），海藻酸鈉（上海埃彼化學(xué)試劑有限公司），其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

250D光照培養(yǎng)箱 （金壇市新航儀器廠），LW200 T多功能生物顯微鏡（上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司），ZNCL－B磁力攪拌器（河南愛(ài)博特科技發(fā)展有限公司）.

1.2 藻種來(lái)源

球等鞭金藻 H29（Isochrysisgalbana29）（天津商業(yè)大學(xué)保藏菌種）.

1.3 培養(yǎng)條件

采用常規(guī)f／2［9］配方，接種為培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的藻種，接種量為105個(gè)／m L，溫度22℃，鹽度28，光照8 000 lx下進(jìn)行培養(yǎng).

1.4 海藻酸鈣包埋法

首先將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的藻液與海藻酸鈉溶液混合，混合后的溶液藻濃度約為105個(gè)／m L，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%.用4＃針頭注射器注射到質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的氯化鈣溶液中，攪拌數(shù)分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球，進(jìn)行培養(yǎng)，膠球濃度為3個(gè)／m L.培養(yǎng)后收集膠球，加入一定量的55 mmol／L檸檬酸鈉溶液解膠，定容后檢測(cè)藻體濃度.

1.5 ACA微膠囊的制備

首先將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的藻液與海藻酸鈉溶液混合，混合后的溶液藻濃度約為105個(gè)／m L，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%.用4＃號(hào)針頭注射器注射到質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的氯化鈣溶液中，攪拌數(shù)分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球.洗滌鈣化后的膠球，并將其轉(zhuǎn)移至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的殼聚糖溶液中，反應(yīng)10 min成膜.洗滌成膜后的膠球，再將其放入海藻酸鈉溶液中反應(yīng)10 min，進(jìn)行覆膜處理.洗滌包覆后的膠球，最后用55 mmol／L檸檬酸鈉溶液將膠球核液化，制成ACA生物微膠囊.最后微膠囊在3個(gè)／m L的濃度下進(jìn)行培養(yǎng).

經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后收集ACA微膠囊，然后機(jī)械破碎并收集上清液.微膠囊碎片用去離子水潤(rùn)洗3次收集上清液，再將收集得到的上清液混合定容測(cè)藻體濃度.

1.6 藻體檢測(cè)

將定容后的藻液用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察藻細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算藻細(xì)胞密度和生長(zhǎng)率K［10］：

式中，N t為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行td的細(xì)胞數(shù)目；N0為實(shí)驗(yàn)初始的細(xì)胞數(shù)目.

1.7 藻體收集及物質(zhì)提取方法

將處理好的藻液經(jīng)5 000 r／min離心，棄去上清液，收集沉淀得到藻體，用冷凍干燥法得到凍干藻粉.進(jìn)行研磨，過(guò)100目篩.

提取溶劑選用藻類物質(zhì)提取常用方法所采用的溶劑進(jìn)行提取［12－15］.具體操作方法為：稱取5 g藻粉，分別加入100 m L 0.2 mol p H7.0磷酸緩沖液體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液、甲醇與甲苯的混合液（體積比為3∶1）、乙酸乙酯、丙酮5種溶液，充分振蕩，放入冰箱中浸提3 d后取出，5 000 r／min離心收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制得藻體浸膏（樣品的旋蒸溫度為35℃）.浸膏中加入5倍體積去離子水繼續(xù)旋蒸，重復(fù)2次，去除有機(jī)溶劑.所得浸膏用去離子水潤(rùn)洗，然后冷凍干燥.所得浸提物加二甲基亞砜（DMSO）充分溶解，配制成不同濃度溶液，過(guò)0.22μm膜除菌，放入冰箱備用.

1.8 抑菌實(shí)驗(yàn)

該實(shí)驗(yàn)所采用的受試菌為金黃色葡萄球菌（S aureus）和大腸桿菌（E.coli）.采用紙片法：制備濃度約為105個(gè)／m L的菌懸液，取20 m L菌懸液倒入300 m L溶化并已冷卻至40～45℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，搖勻后迅速分裝于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿15 m L.待凝固后，將20μL各提取液加入已消過(guò)毒的圓形紙片（φ6 mm）上，略干后貼于培養(yǎng)基平板上，同時(shí)作各溶劑的空白對(duì)照，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，24 h）.培養(yǎng)完成后觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑.

2 結(jié)果與討論

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

圖1為不同培養(yǎng)方法下藻細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線.

圖1 不同培養(yǎng)方法球等鞭金藻H29生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of Isochrysisgalbana 29 by using different culture methods

從圖1中可以看到，2種固定化培養(yǎng)的藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀況比懸浮培養(yǎng)的藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀況要滯后2 d左右，懸浮生長(zhǎng)的速率明顯高于固定化細(xì)胞的生長(zhǎng)速率.并且懸浮生長(zhǎng)的藻細(xì)胞數(shù)量明顯高于固定法所得的藻量，ACA微膠囊法次之，海藻酸鈣包埋法最低.

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)法經(jīng)過(guò)第15 d后藻細(xì)胞進(jìn)入衰亡期，生長(zhǎng)量開始下降，而2種固定化培養(yǎng)的藻細(xì)胞仍處于生長(zhǎng)平衡期.由此可知，固定化藻細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，生長(zhǎng)較緩慢，具有較長(zhǎng)的生產(chǎn)周期.這可能是因?yàn)椋阂环矫鏍I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和光線進(jìn)入膠球受到一定程度阻礙使其生長(zhǎng)速率減緩；另一方面這種在較低生長(zhǎng)速度下生長(zhǎng)的藻細(xì)胞既減慢了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，又降低了有害代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生速度這對(duì)于構(gòu)建生物反應(yīng)器，從中獲取活性物質(zhì)及種質(zhì)保存都是十分有利的.

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1為不同培養(yǎng)方法所得藻細(xì)胞采用不同溶劑浸取所得的浸出物對(duì)革蘭氏菌的抑菌效果.

表1 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of antibacterial experiment

從表1可以看到，不同培養(yǎng)方法所得的提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌的抑制作用均優(yōu)于對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑制作用.除水相提取物對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑菌作用外，其它有機(jī)溶劑所提取的物質(zhì)均對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用.而在大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)中，只有甲醇／甲苯混合液、丙酮提取物對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)抑制作用.

不同溶劑提取物的抑菌效果也有所差別.從實(shí)驗(yàn)得出，藻細(xì)胞的水相提取物均無(wú)抑菌效果，由此可知藻體的抗菌活性產(chǎn)物為非極性化合物.并且甲醇／甲苯混合液提取物的抑菌效果均優(yōu)于其它溶劑提取物.不同溶劑對(duì)藻細(xì)胞提取物抑菌活性的影響表明，在篩選具有抑菌活性的微藻時(shí)，要對(duì)多種有機(jī)溶劑進(jìn)行考察，以選擇最合適的提取溶劑.

不同培養(yǎng)方式所得藻提取物的抑菌作用可由表1看出：2種固定化培養(yǎng)方法所得的藻提取物的抑菌效果均達(dá)到或高于懸浮式培養(yǎng)的效果.而2種固定化方法所得的藻提取物抑菌效果相近，且ACA微膠囊法效果略高于海藻酸鈣包埋法.這主要是由于固定化細(xì)胞相比游離培養(yǎng)生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)處于相對(duì)亞適量水平，延遲了藻細(xì)胞的衰老；并且由于ACA微膠囊菌體的代謝水平相比游離法較緩慢，在一定程度上降低了分解代謝的活性，有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累.

3 結(jié)論

對(duì)不同培養(yǎng)方法的藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)不同培養(yǎng)方法所得的藻細(xì)胞提取物的抑菌效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn).

結(jié)果表明：懸浮培養(yǎng)方式細(xì)胞生長(zhǎng)速率快，細(xì)胞生長(zhǎng)量高，但15 d后進(jìn)入衰亡期.固定化培養(yǎng)方法藻細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，可以延遲衰老，有利于抑菌物質(zhì)積累.兩種固定化方法比較，ACA微膠囊方法細(xì)胞的生長(zhǎng)率高于海藻酸鈣包埋法，20 d時(shí)藻體濃度為1.5×106個(gè).

固定化培養(yǎng)的藻細(xì)胞提取物抑菌效果均優(yōu)于懸浮培養(yǎng)方法，2種固定化方法所得提取物抑菌效果相近.其中甲醇／甲苯提取物抑菌效果最高，在50 mg／m L質(zhì)量濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到12 mm和9 mm.

綜合分析球等鞭金藻H29的生長(zhǎng)及其提取物抑菌效果2方面結(jié)果可以得出結(jié)論：ACA微膠囊方法固定化培養(yǎng)球等鞭金藻H29可以得到比較理想的效果，優(yōu)于傳統(tǒng)的懸浮培養(yǎng)方法.

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Study on effects of different culture methods on growth ofIsochrysisgalbanaand antibacterial activities of its extract

SONGWen－jun，WANGXue－qing，F(xiàn)UXiu－juan

（a.College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；b.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，Tianjin 300134，China）

Suspension culture method，calcium alginate gel，alginate－chitosan－alginate（ACA）microcapsule are used to cultureIsochrysisgalbana，and the effects of different culture methods on the growth ofIsochrysisgalbanaare studied.Phosphate buffer，95%ethanol，methanol／toluene（3∶1，），ethyl acetate，acetone are used as solvent to extract antibacterial materials fromIsochrysisgalbana.S.aureusandEscherichiacoliare used as indicative bacteria to study the antibacterial activities of the extract fromIsochrysisgalbana.The results show thatIsochrysis galbanacultured by ACA microcapsule has long growth cycle，and the extract contains high levels of antibacterial materials and has good antibacterial activities.

immobilization；calcium alginate；ACA microcapsule；Isochrysisgalbana；antibacterial

Q938.8

A

1671－1114（2012）01－0070－04

2010－10－28

天津商業(yè)大學(xué)基金資助項(xiàng)目（090101Q）

宋文軍（1967—），副教授，博士，主要從事生物技術(shù)與食品科學(xué)方面的研究.

（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）