付思思，吳志新，王 敏，湯 蓉

（華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北武漢430070）

錦鯉組織細胞體外培養(yǎng)的初步研究＊

付思思，吳志新，王 敏，湯 蓉＊＊

（華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北武漢430070）

為建立來源于錦鯉的細胞系，本文采用組織塊法，對來源于錦鯉（Cyprinus carpio）鰭條、吻端、肌肉、心臟、鰾、腸道、卵巢等組織的細胞進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。在25℃下，添加20%胎牛血清、0.2μg／m L表皮生長因子（EGF）和25 ng／mL成纖維生長因子（FGF）的L－15培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。結果顯示，鰭條、心臟、鰾、吻端、肌肉、腸道、卵巢分別在原代培養(yǎng)第3、6、12、13、15、3、3天，有細胞從組織塊遷出；對長至單層的鰭條、心臟、肌肉細胞進行傳代培養(yǎng)，鰭條細胞已傳至第39代，心臟和肌肉細胞分別傳到第2代和第4代；鰭條、心臟和肌肉細胞分別呈現(xiàn)上皮細胞樣、上皮細胞樣和上皮細胞樣與成纖維狀混合型。第6代錦鯉鰭細胞的染色體計數(shù)，結果顯示，細胞染色體數(shù)目分布范圍為55～154條，2n＝100。病毒敏感性實驗，發(fā)現(xiàn)錦鯉鰭條細胞對草魚出血病病毒（GCRV）和鯉春病毒血癥病毒（SVCV）都敏感，且在24h內(nèi)出現(xiàn)細胞病變（CPE）；但對斑點叉尾鮰病毒（CCV）不敏感。錦鯉鰭條細胞系的建立為后期建立更多的錦鯉細胞系和魚類病毒研究奠定了基礎。

錦鯉；原代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)

錦鯉（Cyprinus carpio）又稱“緋鯉”、“日本錦鯉”，是大型觀賞魚之一，是鯉魚的變種，屬鯉科，鯉屬，根據(jù)色彩、斑紋等分布情況，錦鯉又分為紅白、大正三色、昭和三色等13個品系。錦鯉因其體型好，顏色鮮艷，養(yǎng)殖規(guī)模越來越大。但隨著養(yǎng)殖環(huán)境越來越惡劣，錦鯉的各種傳染性疾病尤其是錦鯉皰疹病毒病開始廣泛傳播。錦鯉皰疹病毒病1998年首次爆發(fā)在以色列，但在1999年才確認其真正病原是錦鯉皰疹病毒（Koi Herpesvirus，KHV），此后在英國、歐洲大陸、美國、日本也都有暴發(fā)。2002年廣東省某養(yǎng)殖場進口的錦鯉出現(xiàn)了暴發(fā)性疾病，死亡率高達80%以上，劉葒等［1］用nested－PCR證實了本次流行的主要病原可能是KHV，同時伴有副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌的繼發(fā)感染。細胞培養(yǎng)分離技術是錦鯉皰疹病毒病最準確的診療方法，但研究表明KHV只能在源自原始宿主細胞中生長，因此，建立來源于錦鯉的細胞系，是進行錦鯉皰疹病毒的分離與鑒定，研究其致病機理，疫苗制備和免疫預防技術的重要基礎［2］。本文對來源于錦鯉的各組織進行細胞培養(yǎng)，初步確定了錦鯉組織細胞的培養(yǎng)條件，并檢測了細胞對鯉春病毒血癥病毒（SVCV）、草魚出血病病毒（GCRV）和斑點叉尾鮰病毒（CCV）的敏感性，為后期建立錦鯉細胞系和研究KHV奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗魚 健康的錦鯉，體質(zhì)量為50～70 g，實驗前于實驗室暫養(yǎng)1周。

1.1.2 試劑 MEM和L－15培養(yǎng)基、兩性霉素B、慶大霉素、青－鏈霉素、表皮生長因子（EGF）、成纖維生長因子（FGF）、Dulbecco's磷酸鹽緩沖液（DPBS）均購自Sigma公司；0.25%EDTA－胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；新生牛血清（NCS）購自杭州四季青公司；4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）購自Amrseco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 按照Lu等［3］的方法進行錦鯉組織細胞的原代培養(yǎng)，并按照弗雷謝尼［4］的技術作原代培養(yǎng)日常維護。

實驗前在25 cm2培養(yǎng)瓶（Greiner）中添加NCS（2～3 m L／個），于生化培養(yǎng)箱（SHP－150）中孵化過夜，第2天吸出培養(yǎng)瓶中的NCS，并將培養(yǎng)瓶置于25℃培養(yǎng)箱中干燥，利于后續(xù)實驗中組織塊貼壁。

實驗時，用75%酒精浸泡魚體數(shù)分鐘進行消毒，然后將魚體置于潔凈托盤中于超潔凈工作臺中進行解剖，取鰭條、吻端、肌肉、心臟、鰾、腸道、卵巢等組織置于AIM培養(yǎng)基（Antibiotic－incubation medium，含有500 U／m L青霉素、500μg／m L鏈霉素、12.5μg／m L兩性霉素B和250μg／m L慶大霉素的2×MEM培養(yǎng)基）中浸泡2 h，期間每半小時換1次AIM培養(yǎng)液。用滅菌消毒后的眼科剪將組織塊剪成1 mm3左右的小塊，將這些組織小塊移到25 cm2培養(yǎng)瓶中，使其分散均勻，然后置于25℃生化培養(yǎng)箱中貼附2～3 h后，吸出殘余的培養(yǎng)液后，向其中添加4 m L的L－15生長培養(yǎng)基（含有20%FBS、200 U／m L青霉素、200μg／m L鏈霉素、5μg／m L兩性霉素B、100μg／m L慶大霉素以及0.2μg／m L EGF和25 ng／m L FGF），于25℃生化培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)，每日于倒置顯微鏡（Leica DMIL）下觀察組織塊貼壁及細胞從組織塊中遷出與生長情況，拍照記錄觀察結果。培養(yǎng)3 d后吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基在3 000 r／min下離心5 min，保留上層2 m L培養(yǎng)基，再向瓶中添加2 m L新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此后每2 d更換1次培養(yǎng)基。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 按照Lu等［3］的方法進行傳代培養(yǎng)，并按照弗雷謝尼［4］的技術作傳代培養(yǎng)日常維護。

當細胞鋪滿瓶底時，棄去舊培養(yǎng)基，吸取2 m LEDTA，清洗細胞單層，在倒置顯微鏡下觀察細胞確認沒有掉下，倒掉EDTA，然后加入2 m L的0.25%EDTA－胰蛋白酶，在倒置顯微鏡下觀察，待80%細胞收縮變圓時加入2～3 m L含有血清的L－15培養(yǎng)基終止消化，并用移液管（Costar）吹吸幾次，使瓶底所有的細胞都脫落，然后將此細胞懸液吸到15 m L離心管（Greiner）中，1 000 r／min離心7 min，收集細胞沉淀，加入8 m L L－15生長培養(yǎng)基，將細胞混合均勻，裝入2個細胞培養(yǎng)瓶中，在瓶上記錄下細胞名稱，代數(shù)以及日期以后，放入25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

首次傳代在細胞鋪滿瓶底70%左右（大約1周）時進行，收集細胞沉淀，加入4 m L L－15生長培養(yǎng)基，將細胞混合均勻，裝入1個細胞培養(yǎng)瓶中。

1.2.3 染色體核型分析 按Earley［5］方法進行染色體核型分析，實驗重復3次。

細胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶（Greiner）中生長約24 h，形成70%～80%融合的單層細胞，棄去舊培養(yǎng)基，加入10 m L新鮮生長培養(yǎng)基和0.2 m L秋水仙堿溶液（1μg／m L，DPBS配制），25℃下繼續(xù)培養(yǎng)12～15 h后，用EDTA－胰蛋白酶消化收集細胞，經(jīng)新鮮配制的固定液（冰醋酸∶甲醇＝1∶3）固定25 min后，滴片，吉姆薩染色15 min，于顯微鏡（Motic BA400）下進行染色體計數(shù)并分析細胞染色體組型。

1.2.4 病毒敏感性測定 參考Zhao等［6］的操作流程進行病毒敏感性檢測，實驗重復3次。

將細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，細胞單層達到80%時，用無血清L－15培養(yǎng)基清洗細胞2次，加入0.2 mL病毒（SVCV，CCV，GCRV，MOI＝0.1）懸液（25 cm2細胞培養(yǎng)瓶）靜置吸附2 h，每20 min輕輕晃動1次，吸棄病毒懸液，用無血清的培養(yǎng)基清洗細胞表面2次，加入含5%FBS的培養(yǎng)基，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞變化，并拍照記錄。當CPE（Cytopathogenic effect，細胞致病作用）出現(xiàn)作為病毒敏感性指標，表明細胞對該病毒敏感。

2 結果與分析

2.1 原代培養(yǎng)

每日觀察原代組織塊，發(fā)現(xiàn)在鰭條、腸道、卵巢組織塊貼壁的第3天即有細胞從組織邊緣遷出，細胞呈現(xiàn)出上皮樣和成纖維樣（見圖1B、F、G）；心臟組織塊貼壁的第6天細胞從組織塊遷出，細胞呈現(xiàn)出上皮樣（見圖1A）；鰾、吻端、肌肉分別是組織塊貼壁以后第12、13、15天細胞從組織塊中遷出（見圖1C、D、E）。

鰭條和心臟組織塊邊緣長出界限清楚的細胞，并呈放射狀生長，形成生長暈，在生長暈上，細胞排列疏密不一大小不等。經(jīng)過1周的培養(yǎng)，鰭條組織塊周圍遷出的細胞單層達70%，同時發(fā)現(xiàn)離組織塊近的區(qū)域的細胞比離組織塊遠的區(qū)域的細胞長得密，細胞生長發(fā)生接觸抑制，部分細胞死亡。

2.2 傳代培養(yǎng)

分別對鰭條、肌肉、心臟細胞進行傳代培養(yǎng)，細胞在經(jīng)過EDTA－胰酶消化傳代后，經(jīng)過4～6 h后即可貼壁生長，均勻的分布于瓶底。第2代鰭條細胞呈上皮細胞樣與成纖維狀混合型（見圖1H），心臟細胞呈上皮細胞樣，肌肉細胞呈現(xiàn)上皮樣和成纖維樣，相比較心臟細胞和肌肉細胞，傳代培養(yǎng)的鰭條細胞增殖活躍，形態(tài)也均勻相似，5～6 d便可繼續(xù)傳代，目前鰭條細胞已傳至第39代。

鰭細胞在經(jīng)過多次傳代以后，細胞狀態(tài)穩(wěn)定，細胞形態(tài)也逐漸由成纖維樣和上皮樣的混合形態(tài)轉變?yōu)樯掀ぜ毎麡樱ㄒ妶D1I），而肌肉細胞傳至第4代，心臟細胞在第2代時，由于細胞數(shù)量少，并且細胞不能快速增殖，使得傳代不能繼續(xù)。

2.3 染色體核型分析

對100個第6代錦鯉鰭條細胞染色體的計數(shù)結果顯示，細胞染色體數(shù)目分布范圍為55～154條，主要分布在97～102條之間（約70%），峰值為100條（見圖2A）。每種生物染色體數(shù)是相對固定的，對于具有非眾數(shù)染色體細胞，很可能是由于低滲過度或制片操作中導致少數(shù)染色體丟失所致，因此確定錦鯉細胞的染色體數(shù)目為2n＝100（見圖2B）。

2.4 病毒敏感性測定

檢測第6代錦鯉鰭細胞對CCV、SVCV和GCRV的敏感性，結果顯示該細胞對SVCV和GCRV這2種病毒都敏感，并在24 h內(nèi)出現(xiàn)CPE，而對CCV不敏感，7 d內(nèi)都不能出現(xiàn)CPE（見圖3）。

圖1 不同組織遷出的原代細胞Fig.1 Primary cells of different tissues

圖2 第6代錦鯉鰭條細胞的染色體分布（A）及細胞染色體照片（B）Fig.2 Frequency distribution of chromosomes of fin cells（A）and phase－contrast photomicrograph of fin cells（B）cellular chromosomes arrested in metaphase at passage 6

圖3 感染不同病毒的錦鯉鰭條細胞Fig.3 Photomicrographs of fin cells infected by different fish viruses

3 討論

魚類細胞培養(yǎng)的系統(tǒng)研究和建立細胞系的實踐大約開始于1960年代初，Wolf在1962建立了第1個公認的真骨魚類永久性細胞系——虹鱒性腺細胞系（RTG－2），隨后各種魚類的細胞系也相繼建立。據(jù)Fryer和Lannan統(tǒng)計，到1994年為止，至少已建立了159株魚類細胞系，其中，淡水魚類和溯河洄游性魚類占多數(shù)，一共有125株，分別來源于21科的52種魚類的不同組織；而海水魚類細胞系的研究工作發(fā)展相對緩慢，僅有34株，分別來源于13個科的22種海水魚類的不同組織［7］。我國魚類的組織培養(yǎng)是1980年代初由于病毒性魚病研究的展開而開始的。1981年，張念慈和楊廣智成功的建立了草魚吻端組織細胞株ZC－7901及其上皮樣細胞亞株ZC－7901S1［8］。1986年，左文功成功建立了草魚腎臟組織細胞系CIK［9］。到1995年，我國建立的細胞系已有29個，涉及到11種魚類的吻端，腎臟，卵巢，尾鰭，鰾，性腺，肝臟，胚胎，囊胚，原腸腔和鰭條等［10］。本文采用組織塊法進行錦鯉鰭條、吻端、肌肉、心臟、鰾、卵巢和腸道的原代培養(yǎng)，以期建立相應的細胞系。

組織塊法是動物細胞培養(yǎng)中常用方法之一，適用于各種組織的原代培養(yǎng)，具有快速、簡單、高效等優(yōu)點，與消化法相比較，從組織塊遷出的細胞貼壁穩(wěn)定、生長迅速，可生成穩(wěn)定的單層細胞。實驗發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)過程中，離組織塊近的細胞比離組織塊遠的區(qū)域長得密，細胞還沒有鋪滿瓶底時，組織塊鄰近的細胞發(fā)生接觸抑制，部分細胞死亡，因此當細胞鋪滿瓶底70%左右（大約1周）時進行第1次傳代，且由于細胞量少，同時早期傳代細胞對消化酶較敏感，極易消化過度而出現(xiàn)大量死亡，故第1次傳代，不采用分瓶擴大培養(yǎng)方法，僅接種于1個培養(yǎng)瓶中。

孟彥等［11］建立的施氏鱘（Amur sturgeon，Acipenser schrencki Brandt）不同組織來源的細胞系，2～3 d即發(fā)現(xiàn)有細胞從組織塊周圍遷出；曾令兵等［12］建立斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus Rafinesque）腎臟組織細胞系，在組織塊貼壁以后36～48 h細胞從組織塊中遷出，3～4 d便長成單層；樊廷俊等［13］建立大菱鲆（Scophthalus maximus）鰭細胞系，組織塊在不同的培養(yǎng)條件下啟動原代培養(yǎng)，細胞從組織塊中遷出的時間不一，但是也都長達40 d；譚鳳霞等［14］建立稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）細胞系，組織塊貼壁第2天就有細胞從組織塊中遷出。本實驗中，鰭條、心臟、鰾、吻端、肌肉、腸道、卵巢分別在原代培養(yǎng)第3、6、12、13、15、3、3天時有細胞從組織塊中遷出。細胞從組織塊中遷出的快慢除了與不同魚類、不同個體、不同組織細胞的生理特異性有關外，還與組織細胞培養(yǎng)中的不同環(huán)境有關。

本文是對來源于錦鯉組織的細胞系建立的初步研究，結果表明在25℃時，采用添加20%胎牛血清、表皮生長因子和成纖維生長因子的L－15培養(yǎng)基啟動原代培養(yǎng)是可行的。魚類是變溫動物，對于冷水性魚類來講，其細胞培養(yǎng)的溫度是4～24℃，溫水性魚類則是15～37℃，錦鯉為溫水性魚類，采用的是其他多數(shù)溫水性魚類細胞培養(yǎng)溫度，為25℃。

相比較肌肉細胞和心臟細胞，其中鰭條細胞生長快速，第1次傳代后約6 d左右可以長滿瓶底，說明鰭條細胞比心臟細胞和肌肉細胞更適應L－15培養(yǎng)基，這與其他學者的研究相一致［11，13－14］，但也有相關學者的研究表明魚類的鰭細胞的最適培養(yǎng)基不是L－15培養(yǎng)基［15－18］，這可能是由于實驗魚的種系不同所致。MEM培養(yǎng)基成分簡單，僅含有12種必須氨基酸、谷氨酰胺和8種維生素；DMEM（高糖型）適用于以糖代謝為主的細胞和分裂活動較為旺盛的細胞培養(yǎng)；L－15是1種設計獨特的培養(yǎng)基，以平衡鹽溶液做基礎，通過高濃度的氨基酸來提高緩沖能力，在正常大氣環(huán)境下提供精確p H，以半乳糖代替葡萄糖作為碳源，有效防止代謝過程中產(chǎn)生對細胞有毒性的乳酸?；贚－15培養(yǎng)基的種種優(yōu)點，L－15培養(yǎng)基在魚類細胞培養(yǎng)中應用較多，尤其是魚類鰭條細胞［19］。細胞接種密度的大小主要影響細胞生長成匯合單層的時間以及持續(xù)培養(yǎng)細胞單層的穩(wěn)定性，在傳代培養(yǎng)過程中，肌肉細胞和心臟細胞的生長速度沒有鰭條細胞快，這可能是由于從原代組織塊獲得的肌肉細胞和心臟細胞量太少。肌肉細胞和心臟細胞在傳了幾代以后就不能繼續(xù)傳代，這可能是由于傳代過程中細胞被胰蛋白酶過度消化而死亡，或者是細胞本身就不能耐受胰蛋白酶的消化。

整倍體染色體組型在描述1個細胞系的特征上是1個重要的參數(shù)。染色體組型分析表明，錦鯉鰭細胞的染色體數(shù)目70%以上為2n＝100，這與正常的錦鯉染色體數(shù)是相一致的［20－21］。這個二倍體染色體數(shù)的比率與其他報道的魚類細胞系相似或略低［22－23］。

本文檢測錦鯉鰭條細胞對GCRV和SVCV的敏感性時，均出現(xiàn)了CPE，而對CCV不敏感，這可能與宿主細胞的種類有關。錦鯉鰭條細胞的建立可為進一步研究草魚出血病病毒和鯉春病毒血癥病毒提供參考依據(jù)。研究表明KHV只能在源自原始宿主細胞中生長，建立來源于錦鯉的細胞系，是KHV的分離與鑒定、致病機理研究及疫苗制備的重要基礎。

綜上所述，通過對來源于錦鯉的鰭條、吻端、肌肉、心臟、鰾、腸道、卵巢等組織的細胞進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，成功的建立了錦鯉鰭條細胞系，初步對其進行了鑒定，并研究了錦鯉鰭細胞對幾種魚類病毒的敏感性，為后期建立更多的錦鯉細胞系和錦鯉皰疹病毒的研究奠定了基礎，對病毒疫苗制備和細胞毒理學研究也具有實際應用價值。

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Study on the in vitro Primary Culture of Tissue Cells from Ornamental Carp，Cyprinus carpio

FU Si－Si，WU Zhi－Xin，WANG Min，TANG Rong
（College of Fisheries，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

To establish cell lines from ornamental carp（Cyprinus carpio），primary cultures of fin，snout，muscle，heart，swim bladder，intestine and ovary of ornamental carp were initiated at 25℃in L－15 medium supplemented with 20%fetal bovine serum，0.2μg／m L epidermal growth factor（EGF）and 25 ng／m L fibroblast growth factor（FGF）by using the tissue explants technique.The cells of fin，heart，swim bladder，snout，muscle intestine and ovary tissue migrated out around the tissues at day 3，6，12，13，15，3 and 3 respectively.The confluent monolayers of cells were rinsed twice with 0.25%trypsin－EDTA solution.The second generation of heart cells，the third generation of muscle cells and the thirtyninth generation of fin cells were obtained.The morphologies of heart cells and fin cells were both epithelioid，muscle cells were both epithelioid and fibroblast－like.Karyotype analysis showed the number of chromosome ranged from 55 to 154 in the fin cells at passage 6 with a distinct peak at 100 diploid chromosomes.The fin cells were sensitive to Grass Carp reovirus（GCRV）and Spring viremia of carp virus（SVCV），and visible cytopathic effect（CPE）appeared in 24 hours.But the fin cells were not sensitive to Channel Catfish virus（CCV）.The fin cell line could lay a foundation for the establishment of more cell lines from ornamental carp and the research of fish virology.

ornamental carp（Cyprinus carpio）；primary culture；subculture

S965.116

A

1672－5174（2012）03－044－06

農(nóng)業(yè)部引進國際發(fā)進農(nóng)業(yè)科學技術計劃項目（2005Z37）；華中農(nóng)業(yè)大學青年教師科技創(chuàng)新專項（52204－10026）資助

2011－05－19；

2011－06－21

付思思（1986－）女，碩士，研究方向：水產(chǎn)動物疾病學。E－mail：fsssyp1－45＠webmail.hzau.edu.cn

＊＊通訊作者：E－mail：tangrong＠m(xù)ail.hzau.edu.cn

責任編輯 王 莉