(佳木斯大學基礎醫(yī)學院,黑龍江佳木斯154007)

靈芝孢子粉對戊四氮活化海馬神經(jīng)細胞bcl-2表達的研究

張金波,王淑秋,張 虎,張淑紅,張玉萍,劉月霞

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院,黑龍江佳木斯154007)

癲癇是一種短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病,由于腦內神經(jīng)元群過度放電所致的陣發(fā)性腦功能障礙。癲癇發(fā)作后可造成神經(jīng)元死亡,而細胞凋亡是癲癇發(fā)作后神經(jīng)元死亡的主要方式。靈芝孢子粉除了能清除自由基,發(fā)揮免疫調節(jié)作用、對神經(jīng)系統(tǒng)還具有鎮(zhèn)靜和保護的作用。本實驗研究靈芝孢子粉對戊四氮活化大鼠海馬神經(jīng)細胞bcl-2表達變化的影響,進一步探討靈芝孢子粉的作用機制和癲癇與海馬神經(jīng)細胞凋亡調控基因之間的關系。

癲癇;細胞凋亡;神經(jīng)元

癲癇是一種短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病,由于腦內神經(jīng)元群過度放電所致的陣發(fā)性腦功能障礙[1]。癲癇發(fā)作后可造成神經(jīng)元死亡,而細胞凋亡是癲癇發(fā)作后神經(jīng)元死亡的主要方式。細胞凋亡是多個基因調控的過程,包括促凋亡基因和抗凋亡基因。近年來研究表明,bcl-2基因家族在細胞凋亡的調控過程中發(fā)揮重要作用。靈芝孢子粉除了能清除自由基,發(fā)揮免疫調節(jié)作用、對神經(jīng)系統(tǒng)還具有鎮(zhèn)靜和保護的作用[2]。本實驗研究靈芝孢子粉對戊四氮活化大鼠海馬神經(jīng)細胞bcl-2表達變化的影響,進一步探討靈芝孢子粉的作用機制和癲癇與海馬神經(jīng)細胞凋亡調控基因之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

戊四氮(PTZ)、瓊脂糖,(美國Sigma公司);反轉錄試劑盒、PCR試劑盒(寶生物工程有限公司);Trizol,美國 Invitrogen公司;氯仿、異丙醇、溴乙錠(上海生工生物工程技術有限公司);Rnase抑制劑(美國AB I公司);Marker,寶生物工程(大連)有限公司;Taq DNA 聚合酶(寶生物工程有限公司);靈芝孢子粉(佳木斯市野生靈芝種植基地)等。

1.2 主要儀器與設備

高速低溫離心機,美國Sigma公司;醫(yī)用低溫冰箱,日本三洋電器有限公司;PCR儀,美國Thermo公司;PCR電泳儀,北京六一儀器廠;WH-851旋渦混合器,上海手術器械廠;GIS凝膠圖像處理系統(tǒng),上海天能科技有限公司。

1.3 實驗動物及分組

由佳木斯大學實驗動物中心提供雄性、健康3～5月齡、體重(200±20)g的Wistar大鼠30只。隨機分成3組,分別是正常對照組、癲癇模型組和靈芝孢子粉用藥組,每組10只。

1.4 實驗方法

1.4.1 癲癇模型制備

正常對照組用生理鹽水腹腔注射+生理鹽水灌胃;癲癇模型組用PTZ腹腔注射+生理鹽水灌胃;靈芝孢子粉組用PTZ腹腔注射+靈芝孢子粉灌胃。戊四氮用前以雙蒸水新鮮配制成溶液(10g/L),靈芝孢子粉用前以雙蒸水配制成溶液(濃度為30g/L)。致癲癇方法:每日上午11點,灌胃前禁食6h。腹腔注射劑量為35mg/kg,灌胃劑量為150mg/kg,每日1次,持續(xù)28d。停藥1周,再用相同劑量的PTZ測試,凡獲連續(xù)5次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥發(fā)作的大鼠為完全點燃的大鼠癲癇模型。

大鼠點燃標準及驚厥發(fā)作評分標準[3]:

0級,無反應或抽搐停止,沒有行為上的發(fā)作;Ⅰ級,濕狗樣顫動,節(jié)律性嘴或面部抽動;Ⅱ級,面部陣攣、咀嚼或節(jié)律性點頭甩尾;Ⅲ級,頭部顫搐加前肢陣攣性抽搐;Ⅳ級,前肢陣攣、上身直立(袋鼠姿勢)、多肢抽動或強直;Ⅴ級,失平衡、跌倒、四肢抽動;Ⅵ級,全面性強直-陣攣發(fā)作。

1.4.2 RT-PCR 檢測bcl-2的表達

將各組大鼠斷頭取腦,迅速分離海馬,使用Trizol提取海馬組織總RNA,測定其濃度及純度。嚴格按照反轉錄試劑盒推薦步驟操作,將總RNA 反轉錄為cDNA。引物序列:bcl-2上游:5’-CTGAACCGGCA TCTGCACAC-3’,下游:5’-GCA GGTCTGCTGACCTCACT-3’,擴增長度195bp;βactin 上游:5’-GAACCCTAA GGCCAACCGTG-3’,下游:5’-TGGCA TA GA GGTCTTTACGG-3’, 擴 增 長 度 為557bp。引物由上海生工生物工程技術公司合成。bcl-2PCR反應條件為:94℃2min,94℃45s,56℃45s,72℃45s,32個循環(huán),72℃延伸5min。取PCR產(chǎn)物5μL行瓊脂糖凝膠電泳,結果進行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

本研究使用RT-PCR方法比較bcl-2在正常對照組、癲癇模型組和靈芝孢子粉用藥組的mRNA 的表達(圖1)。癲癇模型組和靈芝孢子粉用藥組bcl-2的表達較正常對照組(0.64±0.05)均降低;其中癲癇模型組(0.54±0.12)bcl-2的表達水平與對照組(0.72±0.12)比較明顯降低(P＜ 0.01),靈芝孢子粉用藥組(0.66±0.14)bcl-2的表達水平與癲癇模型組比較明顯升高 (P＜0.05),差異有統(tǒng)計學意義(圖2)。

3 討論

近年研究表明,癲癇發(fā)作可激發(fā)程序性細胞死亡機制即細胞凋亡,并參與腦損傷過程。凋亡一些研究發(fā)現(xiàn),癲癇發(fā)作會發(fā)生細胞凋亡,如Pollard等[4]以海人酸(kainic acid,KA)誘導鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE),當向鼠杏仁核區(qū)注射KA后,可以觀察到杏仁核區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡現(xiàn)象。喻良等用全蝎醇提物致大鼠SE后發(fā)現(xiàn)誘發(fā)SE后6h,大鼠海馬CA 1、CA 3區(qū)出現(xiàn)TUN EL陽性細胞,并逐漸增多[5]。細胞凋亡是涉及多基因調控的復雜的主動死亡過程,其中bcl-2基因家族在細胞凋亡的調控過程中具有重要作用。bcl-2、bax基因是bcl-2基因家族的成員,其表達的蛋白產(chǎn)物bcl-2蛋白抑制細胞的凋亡,而bax蛋白則促進凋亡。而bcl-2蛋白可以與bax蛋白結合形成異二聚體,阻止其轉位,bcl-2蛋白還可以控制Ca2+從內質網(wǎng)釋放,抑制鈣超載,還可以阻止自由基產(chǎn)生,抑制細胞膜上脂質過氧化物的形成,從而起到抗凋亡的作用。bcl-2水平的增高可抑制細胞凋亡,但這種自我保護機制是有限的,bcl-2可通過阻止細胞凋亡的早期環(huán)節(jié)而發(fā)揮作用,可阻止或降低細胞皺縮,染色質濃縮和DNA 裂解的發(fā)生等[6,7]。本研究結果證實,在PTZ點燃癲癇后,模型組和治療組凋亡抑制基因bcl-2表達較正常對照組顯著下降,表明bcl-2基因在細胞凋亡的調控過程中起到抑制作用,而給予靈芝孢子粉治療后,bcl-2的表達與模型組比較顯著增加,提示靈芝孢子粉有效成份能充分作用于腦組織,可以調控bcl-2的表達,借以發(fā)揮抗凋亡的神經(jīng)保護作用。

[1]呂艷婷,王淑秋,宋立德.靈芝孢子粉對戊四氮致癇大鼠大腦皮質及海馬區(qū)PCNA變化的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2010,1(33):37-37

[2]王歡,王淑秋.靈芝孢子粉對戊四氮致癇大鼠腦組織BDN F表達的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2006,29(2):5-7

[3]Martina EV,Uta R,PeterM,et al.Pentylenetetrazole(PTZ)-induced c-fos expression in the hippocampusof kindled rats in suppressed by concom itant treatment w ith Naloxone[J].Brain Res,1998,792(3):299-308

[4]Pollard H,Charriant MC,Cantagrel S,et al.1Kainate-induced apoptoic celldeath in hippocampalneurons[J].Neuroscience,1994,63:7-9

[5]喻良,孫紅斌,梁益,等.全蝎醇提物對Li2Pilo癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響[J].中風與神經(jīng)疾病雜志,2009,26(5):519-522

[6]Kitahara Y,Taga K,Abe H,et al.The effectsof anestheticson cortical spreading depression elicitation and C-fos expression in rats[J].J Neurosurg Anesthesiol,2001,13(1):26

[7]夏永勤,徐如祥,王向宇.亞低溫對重型顱腦損傷后腦循環(huán)動力學的影響[J].中華創(chuàng)傷雜志,2000,16(10):603

Research of ganoderma lucidum spores on pentylenetetrazol activation Bcl-2 expression of hippocampal neurons

ZHANG Jin-bo,WANG Shu-qiu,ZHANG Hu,ZHANG Shu-hong,ZHANG Yu-ping,LIU Yue-xia
(Basis Medical Science College,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Epilepsy is a chronic brain disease characterized by short-term central nervous system disorders due to excessive discharge of brain neurons.Epileptic seizure can cause neuronal death,and cell apoptosis is the main way of neuron death after seizure.One BCL-2 gene fam ilies plays an important role in the regulation of cellapoptosis process.Ganoderma lucidum spores can not only eliminate the free radicals and regulate immune system,but also calm and protect nervous system.The exper iment studies the effect of ganoderma lucidum spores on the expression change of BCL-2 in the hippocampus nerve cells of rats of epilepsy,so as to further explore the relationship between the mechanism of ganoderma lucidum spores(GLS)and controlling gene of apoptosis in the hippocampus nerve cells of Epilepsy.

epilepsy;apoptosis;neuron

R742.1;R285

B

1008-0104(2012)04-0034-01

2012-03-06)

黑龍江省教育廳科研項目,編號:11553110。

張金波(1974～)女,黑龍江綏濱人,碩士研究生,副教授,研究方向:細胞凋亡。

王淑秋(1957～)女,黑龍江佳木斯人,碩士研究生導師,教授,研究方向:神經(jīng)免疫內分泌。E-mail:wang_shuq@163.com。