王復新,張 潔,王 辰,張軍武,侯麗淳,楊 慧

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯154003;2.佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯154002)

尼莫地平對早期腦出血大鼠AQP4mRNA、MMP-9mRNA表達的影響

王復新1,張 潔2,王 辰1,張軍武1,侯麗淳1,楊 慧1

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯154003;2.佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯154002)

目的:探討尼莫地平對早期腦出血周邊組織AQ P4mRNA、MMP-9mRNA表達及由腦出血引起的繼發(fā)性腦水腫與AQ P4、MMP-9的關(guān)系。方法:制做腦出血大鼠模型,分為假手術(shù)組,腦出血組及尼莫地平組,分別觀察6h、1d、3d、5d、7d等5個時間點出血周邊腦組織含水量、AQ P4mRNA、MMP-9mRNA。結(jié)果:(1)腦出血組3d含水量達到高峰,第7天明顯下降,但仍高于正常水平;尼莫地平組3d含水量達高峰,但低于腦出血組。(2)腦出血組AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的表達逐漸升高,3d達到高峰,7d明顯下降,5個時間點明顯高于假手術(shù)組。(3)尼莫地平組大鼠腦水腫程度、AQ P4mRNA、MMP-9mRNA表達逐漸升高,3d達到高峰,明顯低于腦出血組。(4)腦出血的水腫程度與AQ P4mRNA、MMP-9mRNA呈正相關(guān)。結(jié)論:(1)AQ P4、MMP-9參與了出血性腦水腫損傷的過程。(2)尼莫地平可以抑制AQ P4、MMP-9的表達,進而減輕腦水腫的程度。

尼莫地平;早期腦出血;基質(zhì)金屬蛋白酶9

腦出血是神經(jīng)內(nèi)科的常見病之一,而血腫周圍組織的腦水腫可以導致顱內(nèi)壓增高,重者形成腦疝,致死率高。故臨床早期控制腦水腫的進展有利于患者的預后。目前腦水腫的發(fā)生及發(fā)展的病理生理學機制并不完全清楚,有多種因素共同參與,其中許多分子機制參與血腫周圍組織水腫的形成及進展。本實驗研究以腦出血大鼠為模型,在大鼠腦出血后用PCR法記錄腦組織水通道蛋白4(aquaporin-4,AQ P4)mRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)mRNA的表達,探討它們與腦水腫的關(guān)系,通過用尼莫地平干預腦出血大鼠,觀察AQ P4mRNA、MMP-9mRNA及腦水腫的變化,為臨床早期控制腦水腫提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腦出血模型的制作和分組

選取雄性健康的Wistar大鼠150只,體重為200～240g,SPF級。大鼠均在實驗前1w適應實驗室環(huán)境,術(shù)前禁食水12h。假手術(shù)組50只,只進針不注血。參考Rosenberg[1]等方法復制大鼠腦出血動物模型100只,隨機分為腦出血組50只,尼莫地平處理組50只。這三組再隨機分為5個亞組,為6h、1d、3d、5d、7d等5個時間點,各10只。尼莫地平組腹腔注射尼莫地平,劑量為每公斤1mg,頻次為Q 8h。

1.2 腦組織含水量測定

實驗動物麻醉后斷頭取腦,以腦出血點為中心,取其后2mm 腦組織,約140～160mg,先用電子天平稱濕重后,后置于96～100℃的烘箱中24h以上,量取干重,根據(jù)公式:腦組織含水量=(濕重一干重)/濕重×l00%,計算腦組織含水量百分比,表示腦水腫的程度。

1.3 血腫周邊組織AQ P4mRNA、MMP-9mRNA 的檢測

本實驗采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)進行,mRNA提取試劑采用Trizol試劑盒,采用寶生物工程公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應試劑盒。AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的結(jié)果利用凝膠圖像分析,行電泳條帶光密度與β-actin產(chǎn)物的光密度的比值作為本實驗AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的指標。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 腦出血周邊組織含水量的動態(tài)變化

腦出血組3d含水量達高峰后逐漸下降,第7天下降明顯,但仍高于假手術(shù)組 (P＜ 0.05)。尼莫地平組給藥后3d含水量達高峰,各時間點的含水量均低于腦出血組 (P＜ 0.05)。見表1。

表1 實驗大鼠腦出血周邊組織含水量(±s,%,n=10)

表1 實驗大鼠腦出血周邊組織含水量(±s,%,n=10)

與假手術(shù)組比較＊P＜ 0.05;與腦出血組比較#P＜ 0.05。

?

表2 實驗大鼠腦出血周邊組織A PQ 4mRNA(±s,%,n=10)

表2 實驗大鼠腦出血周邊組織A PQ 4mRNA(±s,%,n=10)

與假手術(shù)組比較＊P＜ 0.05;與腦出血組比較#P＜ 0.05。

?

表3 實驗大鼠腦出血周邊組織MMP-9mRNA(±s,%,n=10)

表3 實驗大鼠腦出血周邊組織MMP-9mRNA(±s,%,n=10)

與假手術(shù)組比較＊P＜ 0.05;與腦出血組比較#P＜ 0.05。

?

2.2 腦出血周邊組織A PQ 4mRNA的動態(tài)變化

出血組6hAQ P4mRNA較假手術(shù)組表達增加,隨著出血時間延長,AQ P4表達逐漸增強,3d達高峰,7d逐漸下降(P＜0.05),尼莫地平組各時間點AQ P4mRNA較出血組降低 (P＜ 0.05)。見表2。

2.3 腦出血周邊組織MMP-9mRNA的動態(tài)變化

腦出血組6h較假手術(shù)組即明顯表達MMP-9mRNA,3d達高峰,各時間點的表達量與假手術(shù)組比較均有顯著差異(P＜0.05),尼莫地平組給藥后各時間點AQ P4表達明顯降低 (P＜ 0.05)。見表3。

2.4 相關(guān)分析

腦出血組大鼠AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的表達與腦含水量的變化規(guī)律趨于一致(r= 0.714;0.726,P＜ 0.01)。

3 討論

水通道蛋白是一種位于細胞膜上的內(nèi)在膜蛋白,目前發(fā)現(xiàn)有13種水通道蛋白,其中AQ P4主要位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。AQ P4主要功能為調(diào)節(jié)水鹽代謝,進而影響到細胞內(nèi)外的滲透壓[2]。近年來,在腦組織水腫中AQ P4所發(fā)揮的作用已受到有關(guān)專家和學者的注意。文獻也報道[3],腦組織中AQ P4的表達與腦水腫程度呈正相關(guān)。在腦水腫的形成和進展的過程中,AQ P4發(fā)揮著重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一個大的蛋白家族,需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子可以降解多種細胞外基質(zhì)成分。MMP-9是被糖化的Ⅳ型膠原酶,可以降解Ⅳ型膠原,引起毛細血管的損傷,抑制營養(yǎng)物質(zhì)的通路,導致基底膜破裂,血腦屏障被破壞[4]。MMP-9在腦組織缺血、缺氧和應激情況下釋放增加。在基因轉(zhuǎn)錄的水平上,血小板源生長因子、白細胞介素1等生長因子可以誘導MMP-9增加;Nordqvist研究表明MMP-9與腦卒中后血管源性腦水腫的關(guān)系密切[5]。出血性腦水腫的機制可能血漿蛋白以及凝血酶釋放的物質(zhì)等積聚使細胞內(nèi)外滲透壓改變[6],激活位于血腦屏障基膜上的AQ P4,致使K+外流增多,Na+內(nèi)流增加,導致細胞膜去極化、鈣離子通道開放,大量Ca2+進入細胞,又會促進AQ P4的過度表達,使血腦屏障通透性增加導致腦水腫[7]。MMP-9降解細胞外基質(zhì)會導致血腦屏障的破壞、炎癥反應的擴散和巨噬細胞對內(nèi)皮細胞的黏附等病理過程,加重腦水腫的發(fā)生。本實驗中腦出血組6 h AQ P4mRNA、MMP-9mRNA明顯高于正常水平,3d達到峰值,7d仍比正常組高,腦出血后AQ P4、MMP-9的過度表達與腦水腫的發(fā)展有密切關(guān)系。尼莫地平是二氫吡啶類鈣拮抗劑,作用于二氫吡啶類電壓依賴性鈣通道受體,致使鈣通道受體構(gòu)型發(fā)生變化,從而阻斷Ca2+內(nèi)流,降低細胞內(nèi)Ca2+濃度,提示尼莫地平有可能是通過阻斷Ca2+內(nèi)流,來降低AQ P4、MMP-9的表達。本實驗中尼莫地平組較腦出血組腦含水量明顯減少,AQ P4、MMP-9的表達明顯低于腦出血組?？赡芘c尼莫地平通過抑制炎癥細胞分泌炎癥因子,進而間接地控制了MMP-9的表達。AQ P4、MMP-9與Ca2+關(guān)系的具體分子機制目前還不明確,有待于進一步的實驗研究。本研究結(jié)果表明MMP-9、AQ P4參與了出血性腦水腫的病理過程,尼莫地平可以抑制AQ P4、MMP-9的表達,進而減輕腦水腫的程度,為早期臨床治療出血性腦水腫提供了新的靶點。

[1]Longa EZ,W einstein PR,Carlson S,et al.Reversiblem iddle cerebralartery occlusion w ithoutcraniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84-91

[2]MacAulay N,Hamann S,Zeuthen T.Water transport in the brain:role ofcotransporters[J].Neuroscience,2004,129(4):1031-1044

[3]Ke C,PoonW S,NgHK,et al.Heterogeneous responsesof aquaporin-4 in oedema formation in a replicated severe traumatic brain injury modelin rats[J].NeurosciLett,2001,301(1):21-24

[4]Fuj lmura M,Gasche Y,Morita-Fuj imura Y,et a1.Early appearance of activatedmatrix metalloproteinase-9 and blood brain barrier disruption in m ice after focal cerebral ischem ia and reperfusion[J].Brain Res,1999,842:92-100

[5]Nordqvist AC,Smurawa H,Mathiesen T.Expression of matrixmetalloproteinases 2 and 9 in meningiomas associated w ith different degrees of brain invasiveness and edema[J].J Neurosurg,2001,95(5):839-844

[6]XiG,KeepRF,HoffJT.Mechanism s ofbrain injury after intracerebralhaemorrhage[J].Lancet Neurol,2006,5:53-63

[7]Q ingW G,Dong YQ,Ping DQ,et al.Brain edema after intracerebralhemorrhage in rats:the role of iron overload and aquaporin4[J].Neurosurg,2009,110(3):462-468基金項目:黑龍江省自然科學基金項目,編號:D2007-37。

Effects of nimodipine on the expression of AQP4 andMMP-9 in early cerebral hemorrhage rats

WANG Fu-xin1,ZHANG Jie2,WANG Chen1,ZHANG Jun-wu1,HOU Li-chun1,YANG Hui1
(1.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China;2.Department of Neurology,JiamusiCentralHospital,Jiamusi 154002,China)

Objective:To discuss the expression of nimodipine on AQ P4 andMMP-9mRNA in early cerebral hemorrhage surrounding tissue and the relationship of secondary brain edema caused by cerebral hemorrhage and AQ P4、MMP-9.Methods:Cerebral hemorrhagemodelof ratswere divided into control group,cerebral hemorrhage group and n imodipine group.The water content of brain,AQP and MMP-9 mRNA were observed on 6h,1d,3d,5d,7d after intracerebral hemorrhage.Results:(1)On 3din the ICH group,the brain water content peaked and on 7dit decreased but still higher than normal.On 3din the nimodipine group,the brain water content peaked but still lower than ICH group.(2)AQ P4 and MMP-9 of cerebral hemorrhage group was higher than that of control group at five points,whose expression gradually increased,peaked on 3d,obviously decreased on 7d.(3)Rat’sBrain edema degree and expression of AQ P4 andMMP-9 in nimodipine group were less than those in cerebral hemorrhage group,whose expression gradually increased,peaked on 3d.(4)The degree of intracerebral hemorrhage edema and AQ P4 andMMP-9mRNA were positively correlated.Conclusion:(1)MMP-9 and AQ P4 involved in the process of hemorrhagic brain edema damage.(2)Nimodipine can inhibit the expression of AQ P4 andMMP-9 so as to reduce the degree of brain edema.

n imodipine;cerebral hemorrhage rats;matrixmetalloproteinase-9

R743.34

B

1008-0104(2012)04-0001-02

2012-04-15)

王復新(1956～)男,黑龍江佳木斯人,教授,碩士,碩士研究生導師,從事腦血管病發(fā)病機理與臨床的研究。