蔡 俊

(武警重慶總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400061)

肺炎克雷伯菌是引起臨床細(xì)菌感染最常見的革蘭陰性桿菌之一。近年來的研究顯示，該菌對(duì)頭孢曲松等第3代頭孢菌素高度耐藥，對(duì)頭霉素類及阿莫西林/克拉維酸等β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥的耐藥率也日益增高[1-3]，其原因可能與這些耐藥菌株不僅產(chǎn)生ESBLs，同時(shí)還產(chǎn)生對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有較強(qiáng)滅活作用的質(zhì)粒型AmpC酶有關(guān)[2-5]。及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)臨床產(chǎn)AmpC酶菌株，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗菌藥物，減少耐藥菌株的產(chǎn)生和播散具有重要的臨床意義?，F(xiàn)對(duì)本院臨床分離的116株肺炎克雷伯菌的耐藥性、AmpC酶表型及基因型分布情況進(jìn)行檢測(cè)和分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2010年7月至2011年6月重慶武警總隊(duì)醫(yī)院臨床分離的無重復(fù)肺炎克雷伯菌116株，其中呼吸道標(biāo)本85株,血液標(biāo)本11株,中段尿10株，創(chuàng)面分泌物6株，其他標(biāo)本來源4株。以肺炎克雷伯菌T015作為AmpC酶檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照株，以臨床分離的對(duì)頭孢菌素全部敏感的肺炎克雷伯菌株作為AmpC酶陰性對(duì)照株，大腸埃希菌ATCC25922為藥敏質(zhì)控株。

1.2病原菌的分離培養(yǎng)、鑒定及藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌的分離培養(yǎng)按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)進(jìn)行，采用常規(guī)生化試驗(yàn)及法國(guó)生物梅里埃Vitek2-compact細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌的鑒定。藥物敏感試驗(yàn)采用Vitek2革蘭陰性桿菌藥敏卡片AST-GN13檢測(cè)，頭孢西丁、美羅培南和頭孢哌酮/舒巴坦采用紙片擴(kuò)散法，根據(jù)CLSI2010、CLSI2011標(biāo)準(zhǔn)判定藥敏結(jié)果。MH培養(yǎng)基及藥敏紙片均為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。

1.3AmpC酶表型的檢測(cè) 采用頭孢西丁三維試驗(yàn)法。將頭孢西丁耐藥或中介的菌株加入2 mL胰蛋白胨水中于37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，離心獲取沉淀后加入0.2 mL蒸餾水，混勻，-80 ℃及37 ℃反復(fù)凍融5次，15 000×g 4 ℃離心10 min提取上清液即為酶粗提物。試驗(yàn)時(shí)將大腸桿菌ATCC25922制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛龋鶆蛲坎荚贛-H平板上，平板中央貼上頭孢西丁紙片，距其5 mm處用無菌刀片分4個(gè)方向挖四條放射狀溝槽，分別加入40 μL的試驗(yàn)株、陽(yáng)性及陰性對(duì)照株的AmpC酶粗提取物，35 ℃過夜培養(yǎng)后觀察結(jié)果，若狹縫與抑菌環(huán)交接處出現(xiàn)擴(kuò)大生長(zhǎng)區(qū)域，則測(cè)試菌株產(chǎn)AmpC酶陽(yáng)性。

1.4AmpC基因的PCR檢測(cè) 采用質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)[6]合成6對(duì)AmpC基因通用引物,多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)AmpC酶菌株的AmpC基因。PCR反應(yīng)體系：Mg2+濃度1.5 μmol/L,dNTP 200 μmol/L,TaqE 1.5 U,0.6 μmol/L的引物MOXMF、MOXMR、CITMF、CITMR、DHAMF 和DHAMR；0.5 μmol/L的ACCMF、ACCMR、EBCMF、EBCMR；0.4 μmol/L 的FOXMF 和FOXMR，模板200 ng，10×buffer 2.5 μL，加去離子水至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸5 min。對(duì)PCR反應(yīng)出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的菌株，再用6對(duì)單一引物分別對(duì)該模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以肺炎克雷伯菌T015作為陽(yáng)性對(duì)照株。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA Marker、TaqDNA聚合酶等PCR試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

表1 116株肺炎克雷伯菌中產(chǎn)酶株與非產(chǎn)酶株的耐藥率比較

-：表示無數(shù)據(jù)。

1.5AmpC基因基因分型 PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行，測(cè)序結(jié)果在GenBank上經(jīng)BLAST系統(tǒng)與已知的AmpC基因序列進(jìn)行對(duì)比,確定基因型別。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)粒型AmpC酶檢出率 在分離到的116株肺炎克雷伯菌中，酶提取物頭孢西丁三維試驗(yàn)檢測(cè)，21株AmpC酶陽(yáng)性，產(chǎn)酶陽(yáng)性率為18.1%。21株產(chǎn)酶菌株，其中16株分離自痰液，3株來源于尿液，創(chuàng)面分泌物1株，血液標(biāo)本1株。

2.2質(zhì)粒型AmpC基因分型 對(duì)21株產(chǎn)酶菌株，進(jìn)行AmpC基因多重PCR擴(kuò)增及DHA型單一引物PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出一條約405 bp大小陽(yáng)性條帶。電泳結(jié)果見圖1。對(duì)21株菌AmpC基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中經(jīng)BLAST軟件分析，結(jié)果均與GenBank注冊(cè)號(hào)為HM193083.1的blaDHA-1基因序列完全相一致。

2.3肺炎克雷伯菌分離株的耐藥情況 116株肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素的耐藥情況見表1。21株產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌多重耐藥情況較嚴(yán)重，對(duì)頭孢菌素類、氨基糖甙類和喹諾酮類抗生素均高度耐藥，耐藥率在50%以上(第4代頭孢菌素頭孢吡肟除外，耐藥率為33.3%)，對(duì)加酶抑制劑復(fù)合藥氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率也高于85%，對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率稍低，分別為42.9%、38.1%，但對(duì)碳青霉烯類抗生素亞安培南和美羅培南仍全部敏感。產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢替坦、頭孢西丁和頭孢他啶5種抗生素的耐藥率遠(yuǎn)高于不產(chǎn)酶菌株(P<0.01)，對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢唑啉和復(fù)方新諾明4種抗生素的耐藥率也高于不產(chǎn)酶菌株(P<0.05)，而對(duì)其余13種抗生素兩組耐藥率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

M:DNA Marker;1:陽(yáng)性對(duì)照；2:陰性對(duì)照；3～7:臨床分離產(chǎn)酶株。

3 討 論

AmpC類β內(nèi)酰胺酶是近年來繼ESBLs之后出現(xiàn)的革蘭陰性桿菌對(duì)新型β內(nèi)酰胺酶類抗生素產(chǎn)生耐藥的另一重要機(jī)制[7]。該酶不僅能水解第1～3代頭孢菌素及頭霉素，且不被臨床上現(xiàn)有的β內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，同時(shí)，由質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶基因能在同種或不同種屬細(xì)菌間傳播，極易造成耐藥性的播散，從而給臨床抗感染帶來了巨大的困難[8-9]。

本研究對(duì)臨床分離的116株肺炎克雷伯菌進(jìn)行AmpC酶檢測(cè)，其中21株確證產(chǎn)AmpC酶，產(chǎn)酶陽(yáng)性率為18.1%，與張運(yùn)麗[9]和美國(guó)Rajni等[10]的報(bào)道結(jié)果相近，高于泰國(guó)Singtohin等[11]報(bào)道的0.8%、日本Yamasaki等[12]報(bào)道的0.13%以及崔雪萍等[3]2.8%的報(bào)道，但低于韓國(guó)Yoo等[13]39.3%和董方等[8]38.9%的報(bào)道。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶自1989年發(fā)現(xiàn)至今已報(bào)道有30余種基因型，且其數(shù)目還在不斷增加。不同國(guó)家、不同地區(qū)AmpC酶的流行情況及其基因型別也有所差異。目前，全球流行最多的AmpC酶基因型是CMY-2，主要分布在法國(guó)、德國(guó)、西班牙等國(guó)[14]，在美國(guó)以ACT-1基因型為主，其次為FOX-5型，法國(guó)、德國(guó)等歐洲國(guó)家以CMY-2型為主，在韓國(guó)及日本以DHA-1型為主[4，15]。在國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶以DHA-1基因型為主[7-8],其他基因型如CMY-2、ACT-1等亦有發(fā)現(xiàn)[16-17]。本研究21株產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌均為DHA-1基因型，與董方等[8]、張運(yùn)麗等[9]、Yoo等[13]的報(bào)道相一致。

近年來的研究報(bào)道[7-9]顯示，肺炎克雷伯菌不僅對(duì)第3代頭孢菌素高度耐藥，而且對(duì)β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥以及頭霉素等抗菌藥物的耐藥情況也日益嚴(yán)重，其原因可能與質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶有關(guān),產(chǎn)酶菌株對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性通常高于非產(chǎn)酶菌株。本研究結(jié)果顯示，21株產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌多重耐藥情況較嚴(yán)重，對(duì)第3代頭孢菌素、頭孢西丁、氨曲南以及哌拉西林的耐藥率在76%～100%，對(duì)氨基糖甙類和喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率也在50%以上，對(duì)酶抑制劑復(fù)合藥氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率高于85%，但對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦以及第4代頭孢菌素頭孢吡肟的耐藥率稍低，分別為42.9%、38.1%、33.3%，對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物亞安培南和美羅培南仍全部敏感。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢替坦、頭孢西丁和頭孢他啶的耐藥率遠(yuǎn)高于不產(chǎn)AmpC酶菌株(P<0.01)，對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢唑啉和復(fù)方新諾明的耐藥率也高于不產(chǎn)酶株(P<0.05)，而對(duì)氨基糖甙類、喹諾酮類以及碳青霉烯類等13種抗菌藥物耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究結(jié)果表明，肺炎克雷伯菌中AmpC酶的攜帶，是導(dǎo)致該菌對(duì)β內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物高度耐藥的重要機(jī)制之一，對(duì)產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌感染的治療，應(yīng)首選碳青霉烯類抗菌藥物。

總之，本院臨床分離肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶株檢出率較高，產(chǎn)酶菌株多重耐藥情況嚴(yán)重，臨床應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果合理選用抗菌藥物，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生。亞安培南和美羅培南可經(jīng)驗(yàn)用于產(chǎn)AmpC酶肺炎克雷伯菌感染的治療。及時(shí)了解本地區(qū)肺炎克雷伯菌AmpC酶攜帶情況及耐藥特征，加強(qiáng)產(chǎn)酶菌株的監(jiān)測(cè)，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物和有效地控制耐藥菌株的播散和流行具有十分重要的臨床意義。

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