林昌海，曾 梅，陳 述，盧亦路，馬用信

(四川大學(xué)華西醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究室暨生物治療國家重點實驗室，成都 61004l)

哺乳動物的精子發(fā)生可以分為精原細胞(spermatogonium)分化為初級精母細胞(primary spermatocyte),初級精母細胞通過減數(shù)分裂形成次級精母細胞(secondary spermatocyte)，次級精母細胞通過有絲分裂形成圓形精細胞(round spermatid)以及圓形精細胞轉(zhuǎn)變成成熟的精子(elongating spermatid)等4個主要階段，其中減數(shù)分裂是精子發(fā)生過程的關(guān)鍵步驟。參與減數(shù)分裂調(diào)控的基因缺失或突變?nèi)菀滓馃o精癥和男性不育。DAZ(deleted in azoospermia)家族就是這些基因中的成員。DAZ基因家族屬于生殖特異性基因，均在生殖細胞中特異表達，共同特點是都包含一個RNA結(jié)合域(RNA-binding domain，RBM)和DAZ序列重復(fù)(DAZ repeat)[1]。目前，已確認DAZ基因家族成員主要有3個，包括1個位于Y染色體上的DAZ基因和2個位于常染色體上的Dazl、Boule基因。在不同物種中，它們在生殖細胞發(fā)育的不同階段起著關(guān)鍵的作用。Boule蛋白是2001年發(fā)現(xiàn)的DAZ家族新成員[2]，在睪丸組織中特異表達，是人精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂轉(zhuǎn)換的主要調(diào)控因子。Boule基因分布于所有后生動物，人類中定位于染色體2q33。Xu等[3]發(fā)現(xiàn)在小鼠和人類中，Boule起始表達于細線期的精母細胞，在偶線期加強，在粗線期達到最高，在雙線期減弱，直至次級精母細胞和早期精細胞中都可以檢測得到。Michael等[4]的實驗結(jié)果表明，在敲除小鼠的Boule基因后，小鼠能夠進行正常的減數(shù)分裂而產(chǎn)生圓形精細胞，但是圓形精細胞卻不能正常地進行精子形態(tài)變化而形成精子。這說明Boule基因在精子形態(tài)變化這一過程中起著關(guān)鍵性的作用。Crem(cyclic AMP-responsive element modulator)基因是一種cAMP反應(yīng)元素調(diào)節(jié)因子，在減數(shù)分裂后精子細胞中高表達，是一種轉(zhuǎn)錄激活因子[5]。Crem基因突變小鼠中[6]，精子形成過程的第一步即被阻斷，生精上皮中后期的精子細胞、成熟精子均缺失，而發(fā)生凋亡的生精細胞數(shù)量顯著增加，從而導(dǎo)致不育。由于Boule和Crem基因最終都能作用于精子成熟這一階段，因此，在Boule和Crem之間可能存在某種關(guān)聯(lián)。本文擬通過凝膠滯后實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)等方法，研究Boule蛋白與Crem基因之間的相互作用方式，揭示Boule蛋白在精子發(fā)生過程中所起的作用。

1 材料與方法

1.1材料 性成熟的小鼠睪丸組織購自華西動物中心7周齡昆明小白鼠；rTaq酶、高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、逆轉(zhuǎn)錄酶購自大連寶生物工程公司；限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；表達載體pGEX-5X-3、大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)本研究室保存；RNA提取試劑盒購自Tiangen公司；Glutathione Sepharose 4 Fast Flow購自GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；T載體試劑(pGEM-T-easy)購自美國Promega公司；SP6/T7探針標(biāo)記試劑盒購自美國Promega公司；Hybond-N+膜購自Amersham Biosciences公司；地高辛檢測試劑盒購自Roche公司。

1.2方法

1.2.1小鼠Boule基因的克隆 引物設(shè)計：根據(jù)GeneBank中Boule的mRNA的序列(NM_029267.3)，經(jīng)過分析所克隆的核苷酸序列、表達載體多克隆位點內(nèi)限制性內(nèi)切酶的情況，設(shè)計并合成引物如下：正向引物：CGC GGA TCC ATG GAG ACC GAG TCC CGG (含有酶切位點BamHⅠ),反向引物：CCG CTC GAG GCC GCT CGA GTC AAA AT (含有酶切位點XholⅠ)。

PCR擴增：PCR反應(yīng)體系為50 μL，94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58.5 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2重組表達載體pGEX-Boule的構(gòu)建 將純化后的Boule的膠回收產(chǎn)物以及pGEX-5x-3質(zhì)粒分別用BamHⅠ和XholⅠ進行雙酶切，37 ℃過夜，然后用Omega Gel Extraction Kit回收。將回收的PCR產(chǎn)物和載體在16 ℃條件下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。最后對重組菌落進行篩選、酶切、測序鑒定。

1.2.3基因工程菌的誘導(dǎo)、表達及純化 pGEX-Boule和pGEX-5x-3表達載體分別轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞。挑取單克隆，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜。第2天以1∶100的比例接種至1 L含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8。加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4～6 h后將培養(yǎng)菌液置于冰上冷卻，于12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體。將收集的菌體用5倍體積的1×PBS懸浮，置冰上，超聲破菌，裂解液于12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清。將蛋白質(zhì)上清液加入到有GST Beads的離心管中，將離心管置于垂直混勻器上，在4 ℃結(jié)合60～90 min。在4 ℃離心機中500 r/min，離心3 min，棄上清液。每0.5 mL GST Beads中加5 mL PBS(1%TritonX-100)并來回顛倒混勻，4 ℃ 500 r/min，離心3 min，棄上清液。重復(fù)步驟4～5次。每0.5 mL GST Beads中加0.5 mL洗脫緩沖液，4 ℃結(jié)合20 min，4 ℃ 500 r/min，離心5 min，收集上清液。

1.2.4提取與Boule蛋白結(jié)合的mRNA 取新鮮睪丸組織，液氮充分研磨，然后加入裂解緩沖液，吸到1.5 mL離心管中，4 ℃，15 000 g離心10 min，收集上清液。將睪丸組織上清液、純化后的蛋白、GST Beads、RNA結(jié)合緩沖液在4 ℃中結(jié)合1 h，然后用RNA結(jié)合緩沖液/0.25%TX(并含有肝素)洗10 min，隨后再用RNA結(jié)合緩沖液/0.25%TX洗4次，用常規(guī)提取RNA的步驟將結(jié)合在GST Beads上的RNA提取出來。最后把從GST、GST-Boule蛋白中分離出來的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.5RT-PCR反應(yīng) 設(shè)計Crem基因5′UTR、CDS和3′UTR特異性引物，利用逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA做模板，進行RT-PCR反應(yīng)。

1.2.6凝膠滯后實驗(EMSA) 根據(jù)RT-PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物連接pGEM-T-Easy Vector載體，根據(jù)插入的方向以及插入的序列中是否含有該酶切位點，用相應(yīng)的酶將載體進行線性化，分別在其擴增引物前加上T7啟動子進行擴增，合成帶有地高辛標(biāo)記的探針。將探針分別和純化后的GST和GST-Boule蛋白作凝膠遷移滯后實驗。

2 結(jié) 果

2.1Boule基因的擴增和pGEX-Boule表達載體構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析可見約900 bp的單一條帶，片段大小與預(yù)期一致。重組質(zhì)粒pGEX-Boule轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定，酶切片段和載體大小與預(yù)期一致(圖1)。

圖1 Boule的PCR產(chǎn)物和pGEX-Boule載體雙酶切瓊脂糖電泳分析

2.2融合蛋白GST-Boule的表達及純化 經(jīng)雙酶切初步鑒定正確的陽性克隆送測序，序列正確的表達載體和空載體pGEX-5x-3分別轉(zhuǎn)化宿主菌(BL21)，IPTG誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)菌經(jīng)過超聲破碎離心后，收集上清液。用GST介質(zhì)純化后，進行SDS-PAGE電泳，在約66 KDa見一條帶，與預(yù)期的GST-Boule大小相符融合蛋白(圖2)。

1:誘導(dǎo)前GST-Boule；2:誘導(dǎo)后GST-Boule；3:誘導(dǎo)后GST-Boule破菌上清液；4:Marker；5:Marker；6:純化后GST-Boule。

2.3通過RT-PCR證實Boule蛋白能與靶mRNA底物結(jié)合 用睪丸總RNA和GST結(jié)合的RNA為對照，進行RT-PCR的擴增。結(jié)果表明Crem5′UTR、Crem CDS和Crem3′UTR都能在總RNA反轉(zhuǎn)錄出來的cDNA中得到，GST-Boule蛋白能夠擴增出Crem3′UTR，而GST蛋白都不能擴增出來(圖3)，說明Boule蛋白能夠與Crem mRNA 3′UTR結(jié)合。

Boule和GST各自擴增結(jié)果：睪丸總RNA(1，4，7)；GST(2，5，8)；GST-Boule(3，6，9)。

2.4EMSA實驗證明Crem能與Boule蛋白結(jié)合 根據(jù)RT-PCR試驗結(jié)果，在后續(xù)試驗，選擇Crem3′UTR進行的研究。利用EMSA驗證Boule蛋白能否與Crem mRNA結(jié)合。首先用探針標(biāo)記試劑盒制備Crem 3′UTR的探針。將不同濃度的GST-Boule蛋白與Crem 3′UTR mRNA探針進行結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GST-Boule蛋白能與Crem 3′UTR mRNA探針結(jié)合，而GST蛋白不能與其結(jié)合(圖4)。進一步說明Boule蛋白能夠與Crem mRNA 3′UTR結(jié)合。

圖4 通過EMSA實驗證明Boule蛋白能與Crem3′UTR mRNA結(jié)合

3 討 論

男性原發(fā)無精與少精癥的遺傳病因正日益受到重視，但由于生精過程的復(fù)雜性，長期以來對精子發(fā)生的病理生理認識不足，導(dǎo)致部分患者診療及預(yù)后判斷上的困難。精子發(fā)生是一個復(fù)雜而且嚴密受控的過程，涉及細胞分裂、分化以及在生精小管微環(huán)境里各細胞之間的作用，涉及眾多的基因在空間和時間上的差異分布和表達[2]。近年來，對與生精過程相關(guān)的基因研究仍未發(fā)現(xiàn)直接的證據(jù)證實某一特定基因與原發(fā)無精和少精相關(guān)，但目前已確定出部分候選基因，如Rbmy基因、DBY基因、DAZ(Deleted in azoospermia)基因家族等[7-8]。Boule是近年來發(fā)現(xiàn)的DAZ基因家族的新成員，在結(jié)構(gòu)上與DAZ家族的其他成員(DAZ和DAZL)有很多共同點[9]，三者均含有一個非常相似的RNA結(jié)合域(RNA-binding domain，RBD)或RNA識別基序(RRM)，而這個RNA結(jié)合域與其他RNA結(jié)合蛋白不同[10]，三者均含有DAZ重復(fù)序列，而這個重復(fù)序列可能與蛋白質(zhì)交互作用有關(guān)[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，DAZ基因僅在靈長類表達，DAZL基因分布于脊椎動物中，而Boule基因在所有后生動物中都有表達，因此，可以推斷與DAZ和DAZL相比，Boule是最原始的精子發(fā)生調(diào)控基因。

Xu等[13]在敲除了果蠅的Boule基因后，其生殖細胞停留在第一次減數(shù)分裂中期而不能進入第二次減數(shù)分裂從而失去生殖能力，而在轉(zhuǎn)入人的Boule基因后，果蠅恢復(fù)了正常的減數(shù)分裂而能夠正常的繁殖。經(jīng)分析，人類和果蠅的Boule蛋白在氨基酸水平上有42%相似性(30%相同)，其中RBM結(jié)構(gòu)域上有80%的相似性。這一研究結(jié)果表明Boule在進化上高度保守而且在精子發(fā)生過程中Boule起著一個至關(guān)重要的作用。Maines等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅中Boule蛋白表達始于第一次減數(shù)分裂前期，調(diào)控Twine的表達，而Twine可磷酸化cdc25進而激活成熟促進因子(MPF)，MPF作為減數(shù)分裂過程中的關(guān)鍵性控制因子使細胞從G2期進入M期完成第一次減數(shù)分裂。Xu等[3]發(fā)現(xiàn)在小鼠和人類中，Boule表達貫穿于減數(shù)分裂和精細胞。Michael等[4]的實驗結(jié)果表明，在敲除小鼠的Boule基因后，小鼠能夠進行正常的減數(shù)分裂而產(chǎn)生圓形精細胞，但圓形精細胞卻不能正常地進行精子形態(tài)變化而形成精子。這說明Boule基因在小鼠精子形態(tài)變化這一過程中起著重要的作用。

由于Boule基因是一種RNA結(jié)合蛋白，為了更好地了解Boule對生殖細胞影響的分子機制，本研究從分離它結(jié)合的靶mRNA著手，研究它對生殖細胞的作用。Crem基因在減數(shù)分裂后精子細胞中高表達，作為一種轉(zhuǎn)錄激活因子，它對一些單倍體生殖細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫拥幕虻募せ钣兄匾饔茫芤种凭毎蛲鯷14]。本研究結(jié)果表明Boule蛋白能夠結(jié)合Crem基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)，提示Boule蛋白通過結(jié)合Crem mRNA 3′UTR的方式來調(diào)控Crem蛋白的表達。在Boule基因缺失的小鼠中，Crem基因的mRNA不能正常地翻譯表達，因而精細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫拥倪^程不能被激活，導(dǎo)致無成熟精子的形成。

由于Boule基因序列在果蠅、斑馬魚、小鼠、靈長類和人類中高度保守[15]，因此，它們可能擁有相同的靶mRNA，通過研究Boule在這些物種中的靶mRNA，分析這些靶mRNA在進化過程中是否高度保守，以及Boule蛋白是通過哪些方式參與這些靶mRNA的代謝過程，有助于全面深入地了解Boule基因在調(diào)控精子發(fā)生過程中的作用。

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