楊明聰，范小平，王 春

(重慶市口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)研究中心/重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科 401147)

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們的生活節(jié)奏越來越快，工作與生活壓力也越來越大，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病率逐年升高，其患病率已高達(dá)20%左右，在口腔疾病中僅次于齲病和牙周病，位居第三?？谇粷儼l(fā)作時(shí)疼痛明顯，為此，尋求一種簡(jiǎn)便、安全、快捷的治療方法具有重要的臨床意義。人們發(fā)現(xiàn)局部治療是口腔潰瘍最有效的治療方式，但受口腔特殊環(huán)境的影響，療效存在局限性[1]。近年來，隨著超聲醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，超聲作為一種安全有效的治療手段，已廣泛應(yīng)用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)低頻超聲具有顯著的空化作用，能破壞角質(zhì)層的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，增加皮膚黏膜通透性，即具有顯著的增透效應(yīng)[2]；同時(shí)，低頻超聲的機(jī)械振蕩可對(duì)組織產(chǎn)生按摩及松懈作用，增強(qiáng)組織局部血液循環(huán)，刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血管的生成，加速創(chuàng)面愈合[3]。本研究擬通過構(gòu)建大鼠頰囊黏膜潰瘍模型，觀察低頻超聲對(duì)潰瘍愈合時(shí)間及潰瘍組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響，客觀評(píng)價(jià)低頻超聲在大鼠頰囊黏膜潰瘍治療中的效果，為低頻超聲應(yīng)用于臨床口腔潰瘍的局部治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 健康清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20) g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(CQLA-0749)；SOD、MDA測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物實(shí)驗(yàn)材料研究所；甲基紫精(100 mg)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)儀器包括：雙目光學(xué)顯微鏡(Olympus)、低頻超聲治療儀(重慶海扶公司，ZY型，工作頻率為1.00～1.10 mHz，單路晶片輸出聲功率為0.11～3.50 W，脈沖占空比為50%，脈沖輸出頻率為1 kHz)、721 A型分光光度計(jì)(江蘇)、臺(tái)式離心機(jī)(江蘇)。

1.2方法

1.2.1大鼠頰囊黏膜潰瘍模型的建立及分組 36只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)及大鼠頰囊黏膜潰瘍模型組(n=30)；適應(yīng)性飼養(yǎng)及正常光照1周后，改良陳謙明等[4]介紹的制備動(dòng)物潰瘍模型方法，將潰瘍模型組大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)經(jīng)腹腔靜脈注射麻醉后，取仰臥位固定于簡(jiǎn)易手術(shù)臺(tái)上，用平齒鑷撐開上、下頜，暴露頰囊，用5號(hào)皮試針將10 mmol/L的甲基紫精溶液0.25 mL分別注入左、右頰囊的黏膜下約0.80 cm處，最后，用100 ℃、直徑為5 mm的鐵釘在左右頰囊熱損傷處理3 s，24 h后制成大鼠頰囊黏膜潰瘍模型。根據(jù)不同的處理方式，將頰囊黏膜潰瘍模型大鼠隨機(jī)分為潰瘍組(n=6)、藥物組(n=6)及低頻超聲組(n=18)；低頻超聲組大鼠按超聲波輸出功率再分為1.10、1.58、2.06 W組，每組6只。

1.2.2處理方法 對(duì)照組及潰瘍組大鼠正常飼養(yǎng)，不做任何處理；藥物組大鼠在乙醚麻醉下用1%碘甘油局部涂擦潰瘍處[5]，1次/天，連續(xù)3 d；低頻超聲組按超聲波輸出功率分別給予相應(yīng)的脈沖低頻超聲處理90 s(在大鼠頰囊潰瘍對(duì)應(yīng)外側(cè)皮膚處涂超聲偶聯(lián)劑后，將超聲探頭置于頰囊外側(cè)皮膚)，1次/天，連續(xù)3 d。

1.2.3大鼠頰囊黏膜潰瘍愈合時(shí)間的觀察 處理結(jié)束24 h后，各組隨機(jī)選取3只大鼠進(jìn)行潰瘍愈合時(shí)間的觀察，持續(xù)8 d。

1.2.4大鼠頰囊黏膜潰瘍組織勻漿的制備 各組處理結(jié)束24 h取余下的3只大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)經(jīng)腹腔靜脈注射麻醉，用注射針頭蘸取甲紫在潰瘍上下左右四限處刺入黏膜,標(biāo)記潰瘍部位和面積大小，取兩側(cè)黏膜潰瘍組織，用4 ℃生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干后稱質(zhì)量，將組織剪碎，置于勻漿器中加入生理鹽水，將其研磨成10%的組織勻漿，隨后將勻漿液離心10 min(3 000 r/min)，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5大鼠頰囊黏膜潰瘍組織中SOD、MDA含量的檢測(cè) 按檢測(cè)試劑盒說明，采用分光光度法測(cè)定樣品管的吸光度值，計(jì)算組織中SOD、MDA的含量。計(jì)算公式為：

2 結(jié) 果

2.1大鼠頰囊黏膜潰瘍的愈合時(shí)間 采用改良陳謙明法，24 h后大鼠頰囊部位出現(xiàn)明顯潰瘍。各組大鼠頰囊黏膜潰瘍的愈合時(shí)間見圖1。潰瘍組大鼠在觀察第7天開始有潰瘍愈合，第8天完全愈合；藥物組大鼠在觀察第6天有2只愈合，第8天全部愈合；低頻超聲組均在觀察第4天開始有潰瘍愈合，第6天全部愈合。藥物組及低頻超聲組大鼠頰囊黏膜潰瘍的平均愈合時(shí)間均比潰瘍組短(P<0.05)，但不同功率低頻超聲組大鼠頰囊黏膜潰瘍的愈合時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2大鼠頰囊黏膜潰瘍組織中MDA、SOD含量的比較 處理結(jié)束24 h后，各組大鼠頰囊黏膜潰瘍組織中MDA、SOD含量有一定差異。SOD含量低頻超聲組較潰瘍組顯著升高(P<0.05)，與對(duì)照組,、藥物組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，潰瘍組較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；MDA含量低頻超聲組較潰瘍組顯著降低(P<0.05)，與對(duì)照組、藥物組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，潰瘍組較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，見表2。

圖1 各組大鼠口腔潰瘍的愈合時(shí)間

表2 各組大鼠頰囊黏膜組織中MDA、SOD含量的比較

3 討 論

近年來，越來越多的資料表明，口腔黏膜病的發(fā)病率逐年升高。同時(shí)由于其發(fā)病因素的不確定性及治療方法的復(fù)雜性，該疾病的治療日漸成為廣泛關(guān)注的課題，尤其是口腔黏膜病中發(fā)病率最高的口腔潰瘍更是人們關(guān)注的重點(diǎn)，因其發(fā)病原因不清楚，多采用對(duì)癥治療以及對(duì)可能的病因進(jìn)行治療。對(duì)癥治療主要是以局部治療為主，常受到口腔特殊環(huán)境的限制。

研究報(bào)道的口腔潰瘍發(fā)病因素甚多，尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，推測(cè)其可能是多因素作用的結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)氧自由基可能與其發(fā)病有關(guān)。氧自由基的化學(xué)性質(zhì)活躍，能攻擊細(xì)胞膜上的脂肪酸，產(chǎn)生過氧化物而引發(fā)疾病。但是，由于人體內(nèi)存在自由基清除酶如SOD、過氧化氫酶等，正常情況下機(jī)體產(chǎn)生的自由基可迅速被SOD、過氧化氫酶清除，從而使體內(nèi)環(huán)境維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平[6-7]。SOD活性反映機(jī)體清除氧自由基的能力，但當(dāng)機(jī)體受到外在因素刺激時(shí)，自由基的產(chǎn)生與清除失衡，自由基產(chǎn)生過多，使組織損傷，引發(fā)疾病[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者的SOD活性較健康者明顯降低，而脂質(zhì)過氧化物含量顯著升高，提示在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病機(jī)制中，氧自由基的大量產(chǎn)生以及SOD活性的下降可能是引起組織破壞的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[11]。SOD活性下降，其清除氧自由基的能力下降，脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生過多。而MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其產(chǎn)生的MDA會(huì)使體內(nèi)SOD活性進(jìn)一步降低，過氧化物歧化反應(yīng)清除自由基的能力進(jìn)一步下降，使氧自由基的產(chǎn)生和消除不能達(dá)到平衡，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物不良反應(yīng)，進(jìn)一步加重病情。因此，測(cè)定SOD和MDA的含量變化可以間接反映氧自由基在體內(nèi)的生成和清除情況以及對(duì)組織的損傷程度和體內(nèi)抗氧化防御作用的功能狀況[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠頰囊黏膜潰瘍時(shí)，SOD活性明顯下降，MDA含量明顯升高，當(dāng)用功率為1.10、1.58、2.06 W低頻超聲處理后，頰囊黏膜潰瘍組織SOD含量有顯著升高，而MDA含量明顯下降，提示低頻超聲可能通過對(duì)體內(nèi)SOD活性的影響而對(duì)氧自由基的產(chǎn)生和消除發(fā)揮一定的平衡作用。低頻超聲組與藥物組比較，SOD活性及MDA含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明低頻超聲對(duì)口腔潰瘍的作用與藥物對(duì)口腔潰瘍的作用相似，均對(duì)口腔潰瘍的愈合起促進(jìn)作用。

低頻超聲的溫?zé)嵝?yīng)及空化效應(yīng)可能刺激組織中酶的活性，從而提高機(jī)體的抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用1.10、1.58、2.06 W低頻超聲處理大鼠頰囊黏膜潰瘍后，其潰瘍愈合時(shí)間有所縮短，其中2.06 W組的愈合時(shí)間最短；脈沖低頻超聲輸出功率為1.10，1.58、2.06 W處理組與潰瘍組比較，組織中SOD含量顯著升高(P<0.05)，而MDA含量則相反，在潰瘍組織中其含量顯著增高，低頻超聲處理后其含量降低(P<0.05)。提示在安全劑量范圍內(nèi)，不同功率的低頻超聲可使?jié)兘M織中氧自由基的產(chǎn)生和消除重新達(dá)到平衡，從而促進(jìn)潰瘍的愈合。

綜上所述，脈沖低頻超聲在治療口腔潰瘍時(shí)，對(duì)潰瘍愈合時(shí)間及潰瘍組織中SOD及MDA的含量有一定影響，可促使氧自由基的生成和清除重新達(dá)到平衡，對(duì)口腔潰瘍的愈合發(fā)揮一定的促進(jìn)作用。選擇輸出功率為1.10～2.06 W的脈沖低頻超聲治療口腔潰瘍安全可行。

[1]李秉琦.口腔黏膜病學(xué)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2006：85-90.

[2]Becker BM,Helfrich S,Baker E,et al.Ultrasound with topical anesthetic rapidly decreases pain of intravenous cannulation[J].Acad Emerg Med,2005,12(4):289-295.

[3]Mitragotri S,Coleman M,Kost J,et al.Transdermal extraction of analytes using low-frequency ultrasound[J].Pharm Res,2000,17(4):466-470.

[4]陳謙明,李秉琦.氧自由基對(duì)口腔黏膜損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究：——?jiǎng)游锬Ｐ偷慕J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,1993，11(1):62-64.

[5]馮燕，劉榮明.Smecta治療口腔黏膜復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的臨床探討[J].口腔醫(yī)學(xué)縱橫雜志，2000，16(2)：134-135.

[6]程茜,劉建國(guó),郭玉書,等.銀杏葉提取物對(duì)大鼠復(fù)發(fā)性口腔潰瘍模型超氧化物歧化酶的影響[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,2007,21(6):613-615.

[7]Okabe M,Saito S,Saito T,et al.Histochemical localization of superoxide dismutase activity in rat brain[J].Free Radiol Biol Med,1998,24(9):1470-1476.

[8]Gonzales R,Auclair C,Voisin E,et al.Superoxide dismutase,catalase,and glutathione peroxidase in red blood cells from patients with malignant diseases[J].Cancer Res,1984,44(9):4137-4139.

[9]Breuing KH,Bayer L,Neuwalder J,et al.Early experience using low-frequency ultrasound in chronic wounds[J].Ann Plast Surg,2005,55(2):183-187.

[10]Kawalec JS,Hetherington VJ,Pfennigwerth TC,et al.Effect of a diode laser on wound healing by using diabetic and nondiabetic mice[J].J Foot Ankle Surg,2004,43(4):214-220.

[11]Liu J,Zeng X,Chen Q,et al.An evaluation on the efficacy and safety of amlexanox oral adhesive tablets in the treatment of recurrent minor aphthous ulceration in a Chinese cohort:a randomized,double-blind,vehicle-controlled,unparallel multicenter clinical trial[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2006,102(4):475-481.

[12]Sasaki A,Mabuchi T,Serizawa K,et al.Different roles of nitric oxide synthase-1 and -2 between herpetic and posttherapeutic allodynia in mice[J].Neuroscience,2007,150(2):459-466.