陳學(xué)軍，彭雙玉，2，羅建蓉，2，楊彥明，肖炳光，①

煙草(Nicotiana tabacum L.)育種過程中，加倍單倍體(doubled haploid，DH)在縮短育種進(jìn)程、提高目標(biāo)性狀篩選效率及構(gòu)建數(shù)量性狀基因定位群體等方面發(fā)揮著越來越重要的作用［1－3］。目前，利用花藥培養(yǎng)構(gòu)建煙草DH群體的研究已有報(bào)道：朱惠琴等［4］構(gòu)建了‘G28’בNC2326’和‘K326’בCoker176’2個(gè)烤煙雜交組合DH群體；柴利廣等［5］構(gòu)建了‘B37’(高煙堿)בLAB21’(低煙堿)和‘B37’(中抗黑脛病)בB67’(感黑脛病)2個(gè)DH群體。但是，尚未見以不同類型栽培煙草雜交組合后代為材料進(jìn)行煙草DH群體構(gòu)建的相關(guān)研究報(bào)道。

煙草DH群體構(gòu)建的方式通常是先將花藥培養(yǎng)成再生植株，然后再利用秋水仙素進(jìn)行人工處理使染色體加倍。雖然目前有關(guān)煙草花藥培養(yǎng)的技術(shù)已經(jīng)比較成熟，但要想獲得大量加倍單倍體苗、建立煙草DH群體尚有一定的難度。

鑒于此，作者在前人實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)花藥培養(yǎng)步驟進(jìn)行簡化，并改進(jìn)了DH群體構(gòu)建方法，選擇在品質(zhì)方面表現(xiàn)突出的不同類型煙草品種作為雜交親本開展6個(gè)雜交組合DH群體的構(gòu)建，為下一步開展特色煙葉品質(zhì)育種、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及在煙草常規(guī)育種工作中開展單倍體育種奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的煙草雜交組合為‘紅大’בHicks’、‘紅大’בK326’、‘紅大’ב白肋21’、‘紅大’ב巴斯瑪’、‘白肋21’בTN86’和‘巴斯瑪’ב沙姆遜’，分別以DH1～DH6表示。所有雜交組合于2008年12月10日移栽至云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地溫室內(nèi)，2009年3月20日植株開始陸續(xù)現(xiàn)蕾時(shí)，選取處于花粉單核中、后期的花蕾(花冠剛露出花萼或兩者平齊)，將花蕾置于4℃冰箱中冷藏，備用。

1.2 方法

1.2.1 花藥培養(yǎng) 在超凈臺(tái)上小心剝?nèi)セㄝ嗉盎ü?，將花藥直接接種到裝有H基本培養(yǎng)基［6］(不含生長激素)的蘭花培養(yǎng)瓶中，每瓶50枚花藥，于溫度25℃、光照時(shí)間14 h·d－1、光照度4 000 lx的條件下培養(yǎng)。接種35 d后統(tǒng)計(jì)出苗的花藥數(shù)。然后將具有2～4片真葉的再生苗分別轉(zhuǎn)接到MS基本培養(yǎng)基中，每瓶轉(zhuǎn)接約30株苗。

1.2.2 添加H液體基本培養(yǎng)基對(duì)花藥出苗狀況的影響 選取開花較早的雜交組合DH1和DH2的花藥，按上述方法前處理并接種培養(yǎng)，約15 d后添加20 mLH液體基本培養(yǎng)基，對(duì)照則不添加H液體基本培養(yǎng)基，在上述條件下培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)每枚花藥的出苗數(shù)。每處理100枚花藥，各重復(fù)3次。

1.2.3 染色體加倍處理及再生苗大田移栽 待再生苗長至高3～4 cm(4～6片葉)時(shí)，采用秋水仙素浸苗法(秋水仙素質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.4％)［4］進(jìn)行染色體加倍處理，浸苗時(shí)間為48 h。取出小苗，用清水洗去根部殘余的培養(yǎng)基后移植于漂浮育苗盤(長66 cm、寬34 cm，每盤有162個(gè)直徑3 cm的育苗孔)上；將育苗盤置于育苗池(長7.4 m、寬1.3 m)中，覆蓋塑料薄膜保濕煉苗7 d后將幼苗移到大棚溫室中培養(yǎng)；30 d后移栽至大田中，株距30 cm、行距50 cm，采用常規(guī)栽培措施。統(tǒng)計(jì)各雜交組合的處理苗數(shù)、成苗數(shù)(溫室培養(yǎng)30 d)、大田移栽苗成活數(shù)(移栽后7 d)及染色體加倍苗數(shù)，并計(jì)算成苗率、大田移栽成活率及染色體加倍率。染色體加倍苗數(shù)以開花期觀察的不同倍性苗的葉片、花器官形態(tài)及結(jié)實(shí)情況為準(zhǔn)。

1.2.4 單倍體苗和加倍單倍體苗葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)測(cè)定 選取DH1單倍體苗及其加倍單倍體苗，于移栽后8～13片真葉時(shí)取植株頂端向下第5片葉，撕取葉下表皮置于載玻片上并滴加質(zhì)量濃度5.00 g·L－1的碘－碘化鉀(質(zhì)量比1∶4)溶液染色，加蓋玻片后在40倍顯微鏡下統(tǒng)計(jì)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)；每一葉片隨機(jī)選取5個(gè)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞觀察統(tǒng)計(jì)葉綠體數(shù)并計(jì)算平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

煙草雜交組合花藥再生苗的成苗率、大田移栽成活率及染色體加倍率的計(jì)算公式分別為：成苗率= (加倍處理后成活的再生苗數(shù)/用于加倍處理的再生苗數(shù))×100％；大田移栽成活率=(大田移栽后成活的再生苗數(shù)/加倍處理后成活的再生苗數(shù))×100％；染色體加倍率=(染色體加倍的植株數(shù)/大田移栽后成活的再生苗數(shù))×100％。

采用SAS 8.0分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 煙草雜交組合花藥出苗數(shù)的比較

6個(gè)煙草雜交組合的花藥在接種1個(gè)月左右開始出苗，各雜交組合的出苗數(shù)見表1。6個(gè)雜交組合接種的花藥數(shù)為4 766～6 949枚，出苗數(shù)為9 061～15 925株。其中，DH6花藥的出苗數(shù)最少，為9 061株；DH5接種的花藥數(shù)并不是最多，但出苗數(shù)最多，達(dá)到15 925株。6個(gè)雜交組合每枚花藥的出苗數(shù)差異較大，其中，DH5的每枚花藥出苗數(shù)最多，達(dá)到3.30株，顯著高于其他雜交組合(P＜0.05)；另外5個(gè)雜交組合每枚花藥的出苗數(shù)為1.57～2.01株，各雜交組合間無明顯差異(P＞0.05)。

2.2 添加H液體基本培養(yǎng)基對(duì)煙草雜交組合花藥出苗的影響

在花藥培養(yǎng)約15 d后添加H液體基本培養(yǎng)基，DH1和DH2每枚花藥的平均出苗數(shù)分別達(dá)到3.45和3.52，均高于各自未添加H液體基本培養(yǎng)基的對(duì)照組(2.21和2.03)，差異達(dá)顯著水平(P＜0.05)。

表1 6個(gè)煙草雜交組合花藥出苗數(shù)的比較1)Table1 Comparison of emergence seedling number of anthers of six cross combinations of Nicotiana tabacumL.1)

2.3 煙草雜交組合花藥再生苗的染色體加倍率及成苗率的比較

6個(gè)煙草雜交組合的47 763株花藥再生苗經(jīng)加倍處理后移栽至大田，不同雜交組合的成苗率、大田移栽成活率及染色體加倍率見表2。經(jīng)加倍處理后各雜交組合再生苗的成苗率為21.12％～33.42％，其中，DH3的成苗率最低，為21.12％；DH6的成苗率最高，為33.42％。各雜交組合植株的大田移栽成活率都在90％以上，其中，DH6的大田移栽成活率最高，為98.86％；DH3的大田移栽成活率最低，為91.87％。DH1～DH6再生苗的染色體加倍率為6.64％～10.78％，其中，DH5的染色體加倍率最低，為6.64％；DH4的染色體加倍率最高，為10.78％。

通過上述的花藥培養(yǎng)、染色體加倍處理及大田移栽等一系列步驟，獲得了6個(gè)煙草雜交組合的DH群體，包含的加倍單倍體株數(shù)為126～203株。

表2 經(jīng)加倍處理后6個(gè)煙草雜交組合花藥再生苗成苗、大田移栽成活及染色體加倍狀況的比較Table 2 Comparison of seedling，surviving of transplanted in field and chromosome doubling status of regenerated seedlings from anthers of six cross combinations of Nicotiana tabacum L.after doubling treatment

2.4 煙草雜交組合DH1單倍體苗及其加倍單倍體苗葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)的比較

DH1單倍體苗及其加倍單倍體苗葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)分別為5～13和16～19，平均數(shù)分別為9.27和17.46；二者的比值接近1∶2，且差異顯著(P＜0.05)。朱惠琴等［7］認(rèn)為，煙草氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)隨染色體倍性的提高而增加，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)可作為煙草染色體倍性的鑒定依據(jù)。根據(jù)本研究結(jié)果也可對(duì)煙草雜交組合染色體加倍單倍體苗的倍性進(jìn)行鑒定。

3 討 論

3.1 花藥培養(yǎng)及染色體加倍方法的改進(jìn)

與常規(guī)花藥培養(yǎng)方法相比，作者在無菌環(huán)境下用無菌鑷子剝?nèi)セㄝ嗉盎ü诤笾苯訉⒒ㄋ幗臃N到H基本培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，無需對(duì)花藥進(jìn)行消毒處理，減少了操作過程中對(duì)花藥的損傷，提高了花藥的出苗數(shù)并極大降低了污染率，簡化了操作步驟。同時(shí)，在培養(yǎng)過程中向已培養(yǎng)約15 d的煙草花藥培養(yǎng)瓶中滴加20 mL H液體基本培養(yǎng)基，既使花藥出苗數(shù)得到顯著提高又無需轉(zhuǎn)瓶，提高了培養(yǎng)效率，也減輕了勞動(dòng)強(qiáng)度，對(duì)大規(guī)模開展花藥培養(yǎng)具有一定的意義。

本研究中，作者對(duì)花藥再生苗的染色體加倍步驟也進(jìn)行了一定的簡化，直接用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.4％秋水仙素對(duì)單倍體苗進(jìn)行浸苗，48 h后將處理苗取出并清洗后直接轉(zhuǎn)移到漂浮育苗盤上，再經(jīng)室內(nèi)保濕鍛煉1周后移至溫室中培養(yǎng)30 d，然后將植株移栽到大田中，這樣的操作步驟既提高了工作效率又降低了污染率。另外，用于加倍處理的秋水仙素比較昂貴，在用秋水仙素處理時(shí)將培養(yǎng)基倒扣(生長點(diǎn)向瓶底，培養(yǎng)基向瓶蓋)，可節(jié)省試劑的用量。同時(shí)，將已經(jīng)使用過1次的秋水仙素滅菌后重復(fù)使用1次，可以節(jié)省試劑損耗，但此方法對(duì)DH群體成活率及染色體加倍率的影響有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

3.2 花藥培養(yǎng)及DH群體構(gòu)建中存在的問題

在本研究中，接種1個(gè)月左右花藥開始出苗，不同批次、不同培養(yǎng)瓶及不同群體間的出苗狀況差別極大。例如，個(gè)別批次幾乎所有雜交組合的花藥均未出苗；同一培養(yǎng)瓶中有些花藥出苗幾十株，有些只有1至幾株，有些花藥甚至不出苗。這一現(xiàn)象可能與培養(yǎng)基配制、消毒步驟、花藥選取時(shí)間、花藥部位及花藥的生理狀況有關(guān)。在整個(gè)培養(yǎng)過程中共誘導(dǎo)出68 303株再生苗，其中的2 200株出現(xiàn)白化現(xiàn)象，由于這些白化苗不能正常進(jìn)行光合作用，在育種上沒有利用價(jià)值，造成一定的浪費(fèi)。雖然白化苗的產(chǎn)生可能是基因型決定的，但也不排除溫度過高的影響。

如今，花藥培養(yǎng)技術(shù)已作為一種常規(guī)手段應(yīng)用于育種工作中，但由于研究的對(duì)象和內(nèi)容尚不夠廣泛深入，這項(xiàng)技術(shù)還沒有達(dá)到完全成熟的地步。目前，花藥培養(yǎng)技術(shù)存在的主要問題是：1)白化苗的產(chǎn)生會(huì)影響花藥培養(yǎng)效果，雖然有研究者對(duì)此進(jìn)行了一些研究，但是尚未找到能從根本上克服白化苗形成的方法；2)染色體加倍技術(shù)有待進(jìn)一步改進(jìn)。

本研究中，在進(jìn)行大批量花藥再生苗染色體加倍時(shí)，采用的是秋水仙素浸苗法，經(jīng)加倍處理后再生苗的成活率僅約30％，不可避免地造成加倍單倍體優(yōu)異材料的丟失，而且存活再生苗的染色體加倍率均不到11％，有些甚至更低。因而，在煙草單倍體育種實(shí)踐中，建議采用離體快繁方法開展單倍體加倍研究［8］，這將對(duì)加速煙草品種選育具有重要意義。

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［3］肖炳光，徐照麗，陳學(xué)軍，等.利用DH群體構(gòu)建烤煙分子標(biāo)記遺傳連鎖圖［J］.中國煙草學(xué)報(bào)，2006，12(4)：35－40.

［4］朱惠琴，張憲銀，薛慶中.開發(fā)實(shí)用的染色體加倍體系構(gòu)建成煙草DH群體［J］.分子植物育種，2004，2(5)：643－648.

［5］柴利廣，張俊杰，林國平，等.白肋煙兩個(gè)DH群體的構(gòu)建與染色體倍性的鑒定［J］.中國煙草學(xué)報(bào)，2007，13(2)：33－37.

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