孫清榮，孫洪雁，周廣芳

(山東省果樹研究所，山東泰安271000)

紅棗營養(yǎng)豐富、富含維生素，深受廣大消費者喜愛，但由于棗(Zizyphus jujuba Mill.)樹在生長過程中經(jīng)常受到細(xì)菌、真菌等病害的危害，制約了紅棗的產(chǎn)量。通過品種改良可以獲得優(yōu)良的棗樹品種，但由于棗胚敗育率高及落花落果嚴(yán)重等因素，導(dǎo)致利用常規(guī)雜交育種方法很難達(dá)到品種改良的目的?；蚬こ痰耐庠椿蜻z傳轉(zhuǎn)化技術(shù)為植物抗病品種的選育提供了育種新途徑，而遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的成功應(yīng)用則主要依賴于植物高效再生體系的建立。因此，建立棗樹的高效再生體系是實現(xiàn)其分子育種的首要步驟，對棗樹的品種選育至關(guān)重要。

‘孔府酥脆’棗(Zizyphus jujuba‘Kongfusucui’)是優(yōu)良的鮮食棗品種之一，但該品種植株在種植過程中易感染棗瘋病，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量。有關(guān)棗及其不同品種離體葉片不定梢誘導(dǎo)的研究較多［1－5］，但由于基因型的不同，這些研究成果均不適用于‘孔府酥脆’棗葉片不定梢再生。迄今為止，尚未見有關(guān)‘孔府酥脆’棗離體葉片不定梢再生方面的報道。作者研究了培養(yǎng)方法和外源植物激素添加量對‘孔府酥脆’棗離體葉片不定梢再生的影響，以期獲得‘孔府酥脆’棗葉片不定梢再生的最佳培養(yǎng)條件，為將抗棗瘋病基因轉(zhuǎn)入‘孔府酥脆’棗的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用‘孔府酥脆’棗試管苗由作者所在實驗室培養(yǎng)，在增殖培養(yǎng)基(含2 mg·L－1BA、0.4mg·L－1IBA、30 g·L－1蔗糖和6 g·L－1瓊脂的MS培養(yǎng)基，pH 5.8)上繼代保存約30 d。

1.2 方法

1.2.1 不定梢誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配比 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇WPM培養(yǎng)基［6］為基本培養(yǎng)基，均含有30 g·L－1蔗糖和6 g·L－1瓊脂，并在滅菌前將培養(yǎng)基酸堿度調(diào)整至pH 5.8。根據(jù)添加植物激素的種類及質(zhì)量濃度分為2組培養(yǎng)基(Ⅰ和Ⅱ)，分別用于愈傷組織誘導(dǎo)和不定梢誘導(dǎo)。培養(yǎng)基Ⅰ共6種，分別添加不同質(zhì)量濃度的TDZ(0.1、0.5、1.0 mg·L－1)和IAA(0.1、0.5 mg·L－1)：Ⅰ1含0.1 mg·L－1TDZ和0.1 mg· L－1IAA；Ⅰ2含0.1 mg·L－1TDZ和0.5 mg·L－1IAA；Ⅰ3含0.5 mg·L－1TDZ和0.1 mg·L－1IAA；Ⅰ4含0.5 mg·L－1TDZ和0.5 mg·L－1IAA；Ⅰ5含1.0 mg·L－1TDZ和0.1 mg ·L－1IAA；Ⅰ6含1.0 mg·L－1TDZ和0.5 mg·L－1IAA。培養(yǎng)基Ⅱ共2種：Ⅱ1含0.1 mg·L－1IAA和1.0 mg·L－1GA3；Ⅱ2含0.5 mg·L－1IAA和1.0 mg·L－1GA3。

1.2.2 不定梢誘導(dǎo)培養(yǎng)流程的篩選 不定梢誘導(dǎo)培養(yǎng)基本流程為：從試管苗頂端摘取剛展開的幼嫩葉片，將葉片垂直于中脈橫切后接種于培養(yǎng)基Ⅰ上，葉片近軸面接觸培養(yǎng)基；葉片在培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)3周。在培養(yǎng)基Ⅰ上的培養(yǎng)條件為：暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃；在培養(yǎng)基Ⅱ上的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照時間為14 h·d－1，光照度為2 500 lx。

為確定不同培養(yǎng)方法對不定梢誘導(dǎo)的影響，在上述基本培養(yǎng)流程的基礎(chǔ)上設(shè)置2種培養(yǎng)方式18種培養(yǎng)組合，分別為一步培養(yǎng)方式(在6種培養(yǎng)基Ⅰ上連續(xù)培養(yǎng)7周)和兩步培養(yǎng)方式(在6種培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)4周后再分別轉(zhuǎn)接到2種培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)3周)。另外，為研究愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)時間對不定梢誘導(dǎo)的影響，對兩步培養(yǎng)方式中葉片在培養(yǎng)基Ⅰ上的培養(yǎng)時間進(jìn)行了不同的設(shè)置(分別為1、2、3和4周)。

每處理接種3瓶，每瓶接種10個外植體，各處理均重復(fù)3次。在培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)3周后，記錄再生不定梢的葉片數(shù)并計算不定梢的誘導(dǎo)率，結(jié)果取平均值。

1.2.3 不定梢的增殖和生根培養(yǎng) 將在培養(yǎng)基Ⅱ上獲得的不定梢(芽)轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基(含2.0 mg·L－1BA、0.4 mg· L－1IBA、30 g·L－1蔗糖和6 g·L－1瓊脂的MS培養(yǎng)基，pH 5.8)上進(jìn)行繼代和增殖培養(yǎng)，待不定梢在增殖培養(yǎng)基上長至1.5 cm以上時分別轉(zhuǎn)移至2組生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)。生根培養(yǎng)基分別為：含0.5 mg·L－1IBA、20 g·L－1蔗糖和6 g· L－1瓊脂的1/4MS培養(yǎng)基(pH 5.8)；含0.5 mg·L－1IBA、30 g ·L－1蔗糖和6 g·L－1瓊脂的1/4MS培養(yǎng)基(pH 5.8)。不定梢增殖和生根培養(yǎng)條件與不定梢誘導(dǎo)的光照培養(yǎng)條件相同。

每處理4瓶，每瓶轉(zhuǎn)接15個不定梢，每處理重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后觀察并統(tǒng)計生根的不定梢數(shù)量，計算生根率。生根率的計算公式為：生根率=(生根不定梢數(shù)/接種的不定梢總數(shù))×100％。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPSV3.01數(shù)據(jù)處理軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，并對差異顯著性(P= 0.05)進(jìn)行檢驗。

2 結(jié)果和分析

2.1 ‘孔府酥脆’棗葉片不定梢誘導(dǎo)的3個影響因素分析

采用不同的培養(yǎng)方式，‘孔府酥脆’棗葉片在激素配比不同的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時間后不定梢的誘導(dǎo)率見表1。

表1 培養(yǎng)方式、激素配比及培養(yǎng)時間對‘孔府酥脆’棗葉片不定梢誘導(dǎo)率的影響(±SD)Table 1 Effects of culture method，phytohormone proportion and culture time on induction rate of adventitious shoot from leaves of Zizyphus jujuba‘Kongfusucui’(±SD)

表1 培養(yǎng)方式、激素配比及培養(yǎng)時間對‘孔府酥脆’棗葉片不定梢誘導(dǎo)率的影響(±SD)Table 1 Effects of culture method，phytohormone proportion and culture time on induction rate of adventitious shoot from leaves of Zizyphus jujuba‘Kongfusucui’(±SD)

1)Ⅰ1：0.1mg·L－1 TDZ－0.1 mg·L－1 IAA；Ⅰ2：0.1mg·L－1 TDZ－0.5 mg·L－1 IAA；Ⅰ3：0.5 mg·L－1 TDZ－0.1 mg·L－1 IAA；Ⅰ4：0.5 mg·L－1 TDZ－0.5 mg·L－1 IAA；Ⅰ5：1.0 mg·L－1 TDZ－0.1 mg·L－1 IAA；Ⅰ6：1.0 mg·L－1 TDZ－0.5 mg·L－1 IAA；Ⅱ1：0.1 mg·L－1 IAA－1.0 mg·L－1 GA3；Ⅱ2：0.5 mg ·L－1 IAA－1.0 mg·L－1 GA3.2)數(shù)據(jù)為葉片在培養(yǎng)基Ⅰ上連續(xù)培養(yǎng)7周或分別培養(yǎng)1、2、3或4周后再轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)3周后的不定梢誘導(dǎo)率 These data indicate induction rate of adventitious shoot from leaves cultured continuously onmediumⅠfor seven weeks，or cultured onmediumⅠfor one，two，three or four weeks，respectively and then cultured on mediumⅡfor three weeks；同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P＜0.05).

培養(yǎng)方式1) Culture method1)不同培養(yǎng)時間的誘導(dǎo)率/％2) Induction rate at different culture times2) 1周One week 2周Two weeks 3周Three weeks 4周Four weeksⅠ1 0.0gⅠ1－Ⅱ1 4.6±1.2e 6.0±1.3d 18.8±6.2cd 39.5±4.3fⅠ1－Ⅱ2 4.9±1.8e 6.1±0.9d 18.2±4.2d 40.2±3.7fⅠ2 0.0gⅠ2－Ⅱ1 15.7±2.5d 18.3±2.5c 25.2±1.9abcd 48.0±3.3eⅠ2－Ⅱ2 27.3±2.5ab 30.1±3.2a 29.7±3.5ab 49.0±3.3eⅠ3 0.0gⅠ3－Ⅱ1 5.0±2.6e 7.3±3.1d 23.7±4.0bcd 58.0±2.2dⅠ3－Ⅱ2 9.6±3.1e 10.9±2.0d 26.3±3.0abc 58.6±3.3dⅠ4 0.0gⅠ4－Ⅱ1 29.3±4.0a 30.3±2.5a 31.7±1.5a 65.2±3.5cⅠ4－Ⅱ2 15.7±3.8d 18.3±3.8c 25.1±4.9abcd 68.2±2.6cⅠ5 0.0gⅠ5－Ⅱ1 9.3±3.5e 10.6±2.7d 28.1±1.6ab 81.6±1.7bⅠ5－Ⅱ2 20.3±4.0cd 21.0±4.4bc 28.3±4.1ab 82.8±3.0bⅠ6 0.0gⅠ6－Ⅱ1 25.3±4.5abc 28.7±3.2a 29.9±4.6ab 88.5±1.3aⅠ6－Ⅱ2 23.3±3.5abc 25.3±4.7ab 27.8±5.2ab 86.2±2.2ab

2.1.1 培養(yǎng)方式的影響 由表1可見，采用一步培養(yǎng)法在6種培養(yǎng)基Ⅰ上連續(xù)培養(yǎng)7周后葉片均沒有分化出不定芽，僅能產(chǎn)生由黃白色變?yōu)楹稚挠鷤M織；而采用兩步培養(yǎng)法，將在培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)不同時間的外植體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基Ⅱ上后，所有處理組都能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定梢，但各處理組不定梢的誘導(dǎo)率不同。說明兩步培養(yǎng)法對‘孔府酥脆’棗葉片不定梢誘導(dǎo)是有效的。2.1.2 培養(yǎng)基中激素配比的影響 由表1還可見，葉片在培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)4周后，培養(yǎng)基Ⅰ中TDZ的質(zhì)量濃度對不定梢的誘導(dǎo)率有顯著影響，隨著TDZ質(zhì)量濃度提高，不定梢的誘導(dǎo)率顯著增加。培養(yǎng)基Ⅰ中生長素IAA的質(zhì)量濃度對葉片不定梢的誘導(dǎo)率也有明顯影響，在TDZ質(zhì)量濃度較低(0.1和0.5 mg·L－1)的培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L－1IAA，不定梢的誘導(dǎo)率顯著高于添加0.1mg·L－1IAA的培養(yǎng)基；但在TDZ質(zhì)量濃度較高(1.0 mg·L－1)的培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的IAA，不定梢誘導(dǎo)率的差異不大。

培養(yǎng)基Ⅱ中IAA的質(zhì)量濃度對提高不定梢誘導(dǎo)率基本沒有作用，但對不定梢的生長勢有一定影響。在添加了0.5 mg·L－1IAA的培養(yǎng)基Ⅱ上誘導(dǎo)培養(yǎng)比在含0.1 mg·L－1IAA的培養(yǎng)基Ⅱ上更有利于不定梢的伸長生長，這可能與一定濃度的生長素具有促進(jìn)細(xì)胞伸長、刺激生長的功能有關(guān)［7－8］。

2.1.3 在培養(yǎng)基Ⅰ上不同培養(yǎng)時間的影響 由表1可見，葉片在培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)1、2或3周后再轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)，不定梢的誘導(dǎo)率均較低，絕大部分處理組的不定梢誘導(dǎo)率都在30％以下；而在培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)4周的葉片不定梢的誘導(dǎo)率則大幅度提高，表明適當(dāng)延長在培養(yǎng)基Ⅰ上的培養(yǎng)時間對不定梢誘導(dǎo)率的提高有一定作用。另外，為明確TDZ在‘孔府酥脆’棗葉片不定梢誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中的作用，作者還將葉片在含1.0 mg·L－1TDZ的培養(yǎng)基Ⅰ上的培養(yǎng)時間延長至3個月和4個月，均沒有觀察到不定芽形成，但將葉片轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)1周后即可觀察到不定梢，轉(zhuǎn)接2周后不定梢的誘導(dǎo)率可達(dá)60％以上，說明培養(yǎng)基Ⅱ與‘孔府酥脆’棗葉片不定芽分化啟動有關(guān)。

2.2 不定梢的增殖和生根

將獲得的不定梢轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，不定梢的增殖生長和伸長生長狀況均較良好，月增殖倍數(shù)約為3。生根培養(yǎng)基中其他成分保持一致，分別添加30和20 g·L－1蔗糖，不定梢的生根率分別為89.9％和81.4％，每株生根數(shù)分別為2.8和2.3，顯示生根培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量濃度對不定梢的生根有顯著影響，較高的蔗糖濃度有利于不定梢生根。

3 討論和結(jié)論

雖然棗樹葉片不定梢誘導(dǎo)已在一些品種或類型上獲得了成功［1－4，9－10］，但因基因型的不同，所采用的不定梢誘導(dǎo)方法也有所不同，獲得的再生率也各不相同。陳宗禮等［1］以MS為基本培養(yǎng)基，采用兩步培養(yǎng)方法獲得了‘沾化冬棗’不定梢，不定梢的再生率為40％；而Gu等［2］以WPM為基本培養(yǎng)基，采用一步培養(yǎng)方法使‘沾化冬棗’不定梢再生率最高可達(dá)89.5％；以MS為基本培養(yǎng)基，采用兩步培養(yǎng)方法獲得的‘黃驊冬棗’不定梢的再生率達(dá)92.5％［3］；而以WPM為基本培養(yǎng)基，采用兩步培養(yǎng)方法獲得的酸棗不定梢的再生率為100％［4－5］；通過先誘導(dǎo)葉片不定根，再由不定根誘導(dǎo)不定芽也成功獲得了‘贊皇大棗’不定梢植株，但再生率很低，在20％以下［9］。這些結(jié)果均表明，基因型和培養(yǎng)方法對棗樹葉片不定梢的再生都有重要影響。本研究中，采用兩步培養(yǎng)法的‘孔府酥脆’棗葉片不定梢的再生率較高，與已報道的能獲得較高不定梢再生率的兩步培養(yǎng)方法相似［3－5］，都在含細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定的時間，然后轉(zhuǎn)接至含生長素和赤霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

綜合考慮不定梢誘導(dǎo)率及其生長勢，確定‘孔府酥脆’棗離體葉片不定梢誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)方法為采用兩種培養(yǎng)基(培養(yǎng)基Ⅰ和培養(yǎng)基Ⅱ)的兩步培養(yǎng)法。其中，最佳培養(yǎng)基Ⅰ為含1.0 mg·L－1TDZ和0.5 mg·L－1IAA的WPM培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)基Ⅱ為含0.5 mg·L－1IAA和1.0 mg·L－1GA3的WPM培養(yǎng)基。本實驗結(jié)果為‘孔府酥脆’棗的工廠化育苗及采用生物技術(shù)手段改良品種提供了技術(shù)基礎(chǔ)。這一培養(yǎng)方法也為不同棗品種葉片的不定梢誘導(dǎo)提供了參考依據(jù)。

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