周永剛,張冬梅,魯 琳,羅玉蘭,卞黎霞

崇明水仙為石蒜科 (Am aryllidaceae)水仙屬(NarcissusL.)多年生草本植物,屬于中國(guó)水仙的 1個(gè)栽培類(lèi)型,與漳州水仙和普陀水仙統(tǒng)稱(chēng)為中國(guó)水仙(N.tazettaL.var.chinensisRoem.),在上海市崇明縣已有 400年以上的栽培歷史。崇明水仙具有花香幽雅、水養(yǎng)期和花期長(zhǎng)等特點(diǎn),其重瓣花型以濃郁芳香著稱(chēng)于國(guó)內(nèi)外花卉市場(chǎng),可與英國(guó)玫瑰齊名。目前,崇明水仙的栽培品種很少,且品種混雜,加之品種資質(zhì)退化、品質(zhì)下降及病毒病發(fā)生等因素的影響,已處于幾近滅絕邊緣。2007年,上海市將崇明水仙列入專(zhuān)項(xiàng)拯救計(jì)劃。然而,目前還沒(méi)有關(guān)于崇明水仙遺傳背景的系統(tǒng)研究和報(bào)道。

對(duì)水仙細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行分析是明確其種及品種間差別的基礎(chǔ)。栗田正秀[1]、Kam ae[2]和陳曉靜[3]先后進(jìn)行了關(guān)于中國(guó)水仙核型的研究,均認(rèn)為中國(guó)水仙是同源三倍體 (2n=3x=30)；然而,王瑞等[4]以漳州單瓣花水仙為材料得出的研究結(jié)果則有所不同,確定漳州單瓣花水仙的體細(xì)胞染色體呈三倍體趨勢(shì),但其核型卻顯示出異源三倍體的傾向。在水仙的細(xì)胞學(xué)研究方面,李懋學(xué)等[5]于 1980年對(duì)漳州、舟山和崇明3個(gè)產(chǎn)地的水仙進(jìn)行了染色體組型和 Giem sa C-帶帶型的比較研究,但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)品種間的明確差異。目前,有關(guān)崇明水仙不同類(lèi)型的核型還未見(jiàn)系統(tǒng)的研究報(bào)道。

作者對(duì)崇明水仙細(xì)胞學(xué)研究的前處理溶液 (對(duì)二氯苯飽和溶液和 0.002mo l·L-18-羥基喹啉水溶液)及前處理時(shí)間 (8、10、12和 14 h)進(jìn)行了篩選,并在細(xì)胞學(xué)水平上對(duì)重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞的染色體數(shù)、核型及倍性等進(jìn)行了比較分析,以期為崇明水仙優(yōu)質(zhì)種源的確定、莖和花型的改良、花期的調(diào)控、切實(shí)可行的栽培保種措施的制定及其推廣和應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的重瓣花型和單瓣花型崇明水仙鱗球均來(lái)源于上海市崇明縣百葉水仙花專(zhuān)業(yè)合作社二基地。

1.2 方法

1.2.1 前處理液及前處理時(shí)間的篩選 選取健康、直徑 8 cm的 3年生水仙商品球鱗球,每種花型 10個(gè),經(jīng)低溫處理解除休眠后,剝?nèi)ネ鈱雍稚母善つ?洗凈后置于培養(yǎng)皿中水培,每天換水 1～2次；經(jīng) 3～5 d培養(yǎng),待根尖長(zhǎng)至 0.5～1.0 cm時(shí),在上午 9：00至 10：00時(shí)采集根尖備用。

分別用對(duì)二氯苯飽和溶液和 0.002 mo l·L-18-羥基喹啉水溶液對(duì)根尖進(jìn)行前處理,浸泡時(shí)間設(shè)置 4個(gè)梯度(8、10、12和 14 h),每個(gè)時(shí)間梯度重復(fù)3次。將經(jīng)過(guò)前處理的根尖用蒸餾水清洗后置于卡諾固定液〔V(無(wú)水乙醇)∶V(冰乙酸)=3∶1〕中固定 24 h；再轉(zhuǎn)入 1mo l·L-1HC l溶液中于 60℃恒溫條件下解離 7m in,水洗后用改良石炭酸品紅染色并壓片；采用冰凍法揭片,待干燥后用中性樹(shù)膠封片[6]。使用LeicaDM 2000-4N30系統(tǒng)生物顯微鏡(德國(guó)萊卡公司生產(chǎn))觀察各處理的細(xì)胞分裂情況并計(jì)算分裂指數(shù),從而篩選出適宜的前處理液和前處理時(shí)間。

1.2.2 根尖染色體壓片及觀察 根據(jù)上述預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)根尖進(jìn)行前處理并按照上述實(shí)驗(yàn)操作流程進(jìn)行制片和觀察。使用Leica DM 2000-4N 30系統(tǒng)生物顯微鏡進(jìn)行觀察,每種花型各選擇 50個(gè)染色體清晰、分散良好的中期分裂相進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)和拍照。采用Adobe Photoshop CS 8.0.1圖像處理軟件編輯后,各選取 10張照片按李懋學(xué)等[7]的方法進(jìn)行染色體核型分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理及計(jì)算

分裂指數(shù) =(中期細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù))× 100％。染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)（index of relative length,I.R.L)組成按照 Kuo等的方法[8]進(jìn)行分析,染色體相對(duì)長(zhǎng)度計(jì)算公式為：I.R.L=(染色體長(zhǎng)度/全組染色體總長(zhǎng)度)×100％；臂比計(jì)算公式為：臂比=長(zhǎng)臂長(zhǎng)度 /短臂長(zhǎng)度；按照 Stebbins的標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行核型分類(lèi)；核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù) (asymm etrical karyotype coefficient,A s.k)按照 A rano的方法[10]計(jì)算,計(jì)算公式為：A s.k=(長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng))×100％。

2 結(jié)果和分析

2.1 適宜的前處理液和前處理時(shí)間

為提高崇明水仙根尖體細(xì)胞中期細(xì)胞的分裂指數(shù),采用對(duì)二氯苯飽和溶液和 0.002mo l·L-18-羥基喹啉溶液這 2種常用于植物染色體的前處理液對(duì)根尖進(jìn)行預(yù)處理,并分別設(shè)置了 8、10、12和 14 h的前處理時(shí)間。結(jié)果表明 (表 1)：采用不同的前處理液進(jìn)行前處理,崇明水仙根尖所需的前處理時(shí)間不同；對(duì)二氯苯飽和溶液的前處理效果優(yōu)于 0.002 mol· L-18-羥基喹啉溶液,染色體處于分裂中期的細(xì)胞數(shù)較多,分裂指數(shù)最高可達(dá) 7.21％,且染色體容易分散、結(jié)構(gòu)比較清晰。因此,適宜于崇明水仙細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的前處理液為對(duì)二氯苯飽和溶液,最佳前處理時(shí)間為12 h。

2.2 染色體數(shù)及倍性分析

對(duì)重瓣花型和單瓣花型崇明水仙各 50個(gè)根尖細(xì)胞的中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù),結(jié)果表明：重瓣花型有 46個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)為 30,占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)的92％；單瓣花型有 48個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)為 30,占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)的 96％。由圖 1可見(jiàn)：根據(jù)染色體的形態(tài)、長(zhǎng)度和長(zhǎng)短臂比,重瓣花型和單瓣花型崇明水仙體細(xì)胞的 30條染色體都可以按照每組 3條匹配為 10組,故推測(cè)它們都是 x=10的三倍體。因此,確定崇明水仙體細(xì)胞的染色體數(shù)為 2n=3x=30。

表 1 前處理液和前處理時(shí)間對(duì)崇明水仙根尖體細(xì)胞中期細(xì)胞分裂指數(shù)的影響Tab le 1 Effec t of p re-trea tm en t so lu tion and tim e on d iv ision index ofm etaphase cell in som a tic cells of root-tips of Chongm ing narc issus (N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)

圖 1 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞的染色體形態(tài)Fig.1 Chrom osom em orpho logy in som a tic cellsof root-tips of doub le and single flower types of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)

2.3 染色體核型分析

2.3.1 重瓣花型崇明水仙染色體核型分析 根據(jù)根尖體細(xì)胞染色體的配對(duì)結(jié)果對(duì)重瓣花型崇明水仙的染色體核型參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見(jiàn)表 2；根據(jù)表 2數(shù)據(jù)繪制的染色體核型模式圖見(jiàn)圖 2。

表 2 重瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的核型參數(shù)1)Tab le 2 Karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of doub le flower type of Chongm ing narc issus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)1)

圖 2 重瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體核型模式圖F ig.2 Karyotype d iagram of chrom osom es in som a tic cells of roottips of doub le flower type of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)

在 10組染色體中,第 3、6、7、9和 10號(hào)染色體為近中部著絲點(diǎn)染色體(臂比小于 3),其余染色體均為近端部著絲點(diǎn)染色體(臂比大于 3)；在第 7號(hào)染色體上有隨體,隨體長(zhǎng)度為 0.49μm。染色體組總長(zhǎng)度為40.47μm；長(zhǎng)臂總長(zhǎng)度為 30.95μm,平均長(zhǎng)度為4.05μm。在 10組染色體中第 1號(hào)染色體的總長(zhǎng)度最長(zhǎng),為 6.20μm；第 10號(hào)染色體最短,為 2.00μm；最長(zhǎng)染色體與最短染色體長(zhǎng)度的比值為 3.10。核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)(A s.k)為 76.48％,相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)組成為2n=30=12L+6M2+12S。分析結(jié)果顯示：重瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的核型公式為 2n=3x= 30=15st+15sm(3SAT)。

由表 2還可看出：重瓣花型崇明水仙體細(xì)胞染色體的臂比變化范圍為 1.89～4.71,臂比大于 2的染色體有 9組,占全部染色體組的 90％。根據(jù) Stebbins的核型分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),重瓣花型崇明水仙的體細(xì)胞的染色體核型屬于“3B”型。

2.3.2 單瓣花型崇明水仙染色體核型分析 根據(jù)根尖體細(xì)胞染色體的配對(duì)結(jié)果對(duì)單瓣花型崇明水仙的染色體核型參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見(jiàn)表 3；根據(jù)表3數(shù)據(jù)繪制的染色體核型模式圖見(jiàn)圖 3。

表 3 單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的核型參數(shù)1)Tab le 3 Karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of single flower type of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)1)

在 10組染色體中,第 3、6、8、9和 10號(hào)染色體為近中部著絲點(diǎn)染色體(臂比小于 3),其余染色體均為近端部著絲點(diǎn)染色體(臂比大于 3)；在第 7號(hào)染色體上有隨體,隨體長(zhǎng)度為 0.52μm；染色體組總長(zhǎng)度為42.13μm；長(zhǎng)臂總長(zhǎng) 32.32μm,平均長(zhǎng)度 4.21μm。在10組染色體中第1號(hào)染色體的總長(zhǎng)度最長(zhǎng),為 6.58μm；第 10號(hào)染色體最短,為 2.06μm；最長(zhǎng)染色體與最短染色體長(zhǎng)度的比值為 3.19。核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)(A s.k)為 76.71％,相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)組成為 2n=30= 12L+3M1+3M2+12S。分析結(jié)果顯示：?jiǎn)伟昊ㄐ统缑魉筛怏w細(xì)胞染色體的核型公式為 2n=3x=30=15st(3SAT)+15sm。

圖 3 單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體核型模式圖F ig.3 Karyotype d iagram of chrom osom es in som a tic cells of roottips of sing le flower type of Chongm ing na rc issus(N a rcissus tazetta L. var.ch inensis Roem.)

由表 3還可以看出：?jiǎn)伟昊ㄐ统缑魉筛怏w細(xì)胞染色體的臂比變化范圍為 1.72～5.02,臂比大于 2的染色體有 9組,占全部染色體組的 90％。根據(jù)Stebbins的核型分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),單瓣花型崇明水仙體細(xì)胞染色體的核型屬于“3B”型。

2.3.3 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙染色體平均核型分析 根據(jù)上述觀察和測(cè)量結(jié)果可見(jiàn)：重瓣花型和單瓣花型崇明水仙的根尖體細(xì)胞染色體核型間的差異不明顯,將二者的核型參數(shù)進(jìn)行平均分析得到的結(jié)果見(jiàn)表 4,根據(jù)平均核型參數(shù)繪制的平均核型模式圖見(jiàn)圖4。

在 10組染色體中,第 3、6、8、9和 10號(hào)染色體為近中部著絲點(diǎn)染色體(臂比小于 3),其余染色體均為近端部著絲點(diǎn)染色體(臂比大于 3)；第 7號(hào)染色體具有隨體。染色體組總長(zhǎng)度 41.28μm；長(zhǎng)臂總長(zhǎng) 31.61μm,平均長(zhǎng)度 4.13μm。核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù) (A s.k)為76.57％,相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)組成為 2n=30=12L+6M2+ 12S。分析結(jié)果顯示：崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的平均核型公式為 2n=3x=30=15st(3SAT)+15sm。

由表 4還可以看出：崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體中臂比大于 2的染色體有 9組,占全部染色體組的90％。根據(jù) Stebbins的核型分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),崇明水仙體細(xì)胞染色體的核型屬于“3B”型。

表 4 崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的平均核型參數(shù)1)Tab le 4 Average karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of Chongm ing narc issus(N a rcissus tazetta L.var. ch inensis Roem.)1)

圖 4 崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體平均核型模式圖F ig.4 Average karyotype d iagram of chrom osom es in som a tic cells of roo t-tips of Chongm ing narc issus(N a rcissus tazetta L.var. ch inensis Roem.)

2.3.4 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙染色體核型的比較分析 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體核型參數(shù)的比較結(jié)果見(jiàn)表 5。結(jié)果表明：重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的核型略有差異。相同點(diǎn)為：都屬于典型不對(duì)稱(chēng)的二型核型,染色體數(shù)和倍性相同,核型類(lèi)型同屬于“3B”型,隨體均出現(xiàn)在第 7號(hào)染色體的短臂上,臂比大于 2的染色體組數(shù)占全部染色體組的 90％。差異在于：重瓣花型的第 7號(hào)染色體為 sm型、第 8號(hào)為 st型,而單瓣花型的第 7號(hào)染色體為 st型、第 8號(hào)為 sm型；前者的核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)(A s.k)略小于后者；前者的相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)為 12L+6M2+12S,后者的相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)為 12L +3M1+3M2+12S；前者的最長(zhǎng)染色體與最短染色體長(zhǎng)度的比值略小于后者。綜合李懋學(xué)等[5]的研究結(jié)果,可以認(rèn)為重瓣花型和單瓣花型崇明水仙具有同一起源,二者在形態(tài)特征方面的差異可能是長(zhǎng)期進(jìn)行無(wú)性繁殖和栽培選擇所形成的基因型和生態(tài)型的差異。

表 5 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體核型參數(shù)的比較1)Tab le 5 Com par ison of karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of doub le and single flower types of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)1)

3 討論和結(jié)論

在植物細(xì)胞染色體核型分析過(guò)程中,前處理過(guò)程是使細(xì)胞分裂停止在中期階段而獲得較多中期分裂相的關(guān)鍵步驟,前處理同時(shí)還可以使染色體縮短變粗,便于觀察和統(tǒng)計(jì)。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,針對(duì)不同類(lèi)型水仙,前處理液和前處理時(shí)間有一定差異。前處理時(shí)間過(guò)短,染色體大部分還處于染色質(zhì)狀態(tài),得不到清晰可見(jiàn)的染色體；前處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng),造成染色體過(guò)度縮短,無(wú)法判別著絲點(diǎn),也無(wú)法體現(xiàn)各染色體之間的差異,不能進(jìn)行準(zhǔn)確的核型分析。本實(shí)驗(yàn)中,在染色體制片過(guò)程中利用對(duì)二氯苯飽和溶液前處理 12 h,能夠獲得較多的中期分裂相細(xì)胞。但在 50個(gè)中期分裂相細(xì)胞中,能夠清晰鑒別出具有 30條染色體數(shù)的細(xì)胞數(shù)未達(dá)到 100％,這可能是由于在染色體制片過(guò)程中出現(xiàn)重疊或斷裂所致。

核型分析結(jié)果表明：重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞的染色體核型基本一致,差異較小。染色體數(shù)都為 2n=3x=30,其中包括 18條長(zhǎng)染色體和12條短染色體,短染色體中有 3條具隨體,按照染色體長(zhǎng)短和隨體染色體數(shù)目進(jìn)行配對(duì)可以配成 10組,平均核型公式為 2n=3x=30=15st(3SAT)+15sm。根據(jù)現(xiàn)有研究資料可以確定崇明水仙是三倍體植物。

水仙屬植物染色體數(shù)目和倍性變化復(fù)雜：染色體基數(shù)(x)有 7、10和 11三類(lèi)；除二倍體外,還存在三倍體、四倍體和六倍體；染色體數(shù)從 14～56不等[11-13]。通過(guò)細(xì)胞學(xué)觀察,一些學(xué)者認(rèn)為中國(guó)水仙是三倍體植物[1,5],但是也有學(xué)者持不同觀點(diǎn)。曾滄江等[14]認(rèn)為中國(guó)水仙是二倍體植物；李懋學(xué)等[5]發(fā)現(xiàn)崇明水仙的染色體數(shù)目 2n=30,并據(jù)此推斷崇明水仙為同源三倍體植物。與王瑞[15]報(bào)道的漳州水仙染色體核型相比,崇明水仙的 10組染色體組中有多組出現(xiàn) 3條染色體中 2條體積形態(tài)相似并與另外一條形態(tài)差異較大的現(xiàn)象,尤其是第 7組具隨體的 3條染色體,其中的 2條無(wú)論是長(zhǎng)度、臂比還是隨體長(zhǎng)度都相似,而第 3條則隨體明顯,且染色體長(zhǎng)度在 3條染色體中最短。因此,初步推測(cè)崇明水仙是節(jié)段異源三倍體。這一結(jié)果與朱心武等[16]、莊偉建等[17]和李廣蘋(píng)[18]的研究結(jié)果一致。至于這種核型差異究竟是同源三倍體染色體之間的雜合現(xiàn)象,還是節(jié)段異源三倍體之間的差別,需要通過(guò)分子原位雜交和分子標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

由于長(zhǎng)期以來(lái)一直進(jìn)行無(wú)性繁殖,因此水仙的后代性狀相對(duì)穩(wěn)定。重瓣花型和單瓣花型崇明水仙體細(xì)胞染色體的核型差異較小,但在形態(tài)特征方面則表現(xiàn)出一定的差異,這可能與不同生態(tài)型的差異有關(guān)。從不同生態(tài)型的崇明水仙中選擇形態(tài)性狀較好的類(lèi)型作為優(yōu)質(zhì)種源進(jìn)行迅速繁殖推廣,可達(dá)到對(duì)崇明水仙種源進(jìn)行提純、復(fù)壯和保種的目的,具有重要理論意義。

三倍體植物屬于多倍體范疇,多倍體特性不僅體現(xiàn)在植株速生和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增多上,還體現(xiàn)在植株的生態(tài)適應(yīng)性及抗逆性增強(qiáng)等方面[19]。從長(zhǎng)期的栽培歷史來(lái)看,崇明水仙具有球莖緊實(shí)、水養(yǎng)期及花期長(zhǎng)、適應(yīng)性強(qiáng)、對(duì) SO2和 CO有較強(qiáng)抗性等特性,在形態(tài)和生理上初步顯示出多倍體的物種優(yōu)勢(shì)。目前,利用秋水仙素處理植物組織器官[20]以及原生質(zhì)體融合技術(shù)在多倍體育種上都取得顯著效果[21]。多倍體育種可增加原細(xì)胞型不具有的新特性[22],可使花卉的花器官增大、色彩更艷麗或花期延長(zhǎng)[23]。綜上所述,基于崇明水仙所具有的三倍體遺傳背景,對(duì)崇明水仙進(jìn)行倍性改良具有很大的應(yīng)用潛力。然而,由于崇明水仙鱗莖小、少側(cè)腳、葉片較小、花多獨(dú)枝且不易造型,因此,可以考慮采用秋水仙素處理使染色體加倍的方法誘導(dǎo)崇明水仙產(chǎn)生突變,以獲得鱗莖增大、側(cè)腳和花枝增多、花器官增大的崇明水仙品種。

不同植物都有自身最適宜的染色體倍性水平,并不是染色體數(shù)越多、倍性越高越佳。如果超過(guò)了一定的倍性限度,就會(huì)破壞植物的遺傳平衡和生理平衡,從而導(dǎo)致許多缺陷的產(chǎn)生,尤其在同源多倍體中這一現(xiàn)象更為突出。中國(guó)水仙是異源三倍體植物,其多倍體的誘導(dǎo)與二倍體的純合加倍有所區(qū)別,誘導(dǎo)多倍體時(shí)極易出現(xiàn)嵌合體,且目前已有報(bào)道的是誘導(dǎo)出鱗莖球大于三倍體的六倍體[15]。因此,對(duì)于崇明水仙多倍體的誘導(dǎo)及其最適倍性有待于進(jìn)一步深入研究。

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