陳 濤，陳彩珍，盧 健

耐力、力量和混合運(yùn)動(dòng)對(duì)成年C57BL／6小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活信號(hào)通路的影響

陳 濤，陳彩珍，盧 健

目的：研究耐力、力量、混合運(yùn)動(dòng)3種訓(xùn)練方式激活靜息狀態(tài)衛(wèi)星細(xì)胞的能力。方法：將32只3月齡C57BL／6小鼠隨機(jī)分成4組：安靜組（C，n＝8），耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組（E，n＝8），力量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組（S，n＝8），混合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組（M，n＝8）。經(jīng)過28周運(yùn)動(dòng)干涉后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)脛骨前肌衛(wèi)星細(xì)胞激活信號(hào)通路中相關(guān)基因（nNOS，MMP－2，HGF，c－met）mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果：1）與安靜組相比，3組運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組C57BL／6小鼠脛骨前肌與體重的比值增加；2）耐力訓(xùn)練組nNOS，HGF，c－met mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，MMP－2 mRNA無顯著性差異；3）力量訓(xùn)練組nNOS，MMP－2，HGF，c－met mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加；4）混合訓(xùn)練組nNOS，MMP－2，c－met mRNA轉(zhuǎn)錄水平無顯著性變化，HGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。結(jié)論：力量運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞的激活具有明顯的促進(jìn)作用，在維持骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞池的數(shù)量和促進(jìn)骨骼肌肥大中具有顯著意義；耐力運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的激活，在防止骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量減少，在維持骨骼肌質(zhì)量和力量上，也有其可取之處；混合訓(xùn)練組在促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞激活的過程中，混合運(yùn)動(dòng)的效果并不是預(yù)期所設(shè)想的耐力和力量運(yùn)動(dòng)的效果疊加，提示在維持衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和促進(jìn)骨骼肌肥大上應(yīng)考慮運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、時(shí)間和頻率，合理安排耐力和力量運(yùn)動(dòng)。

衛(wèi)星細(xì)胞；耐力；力量；混合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）；基質(zhì)金屬酶蛋白2（MMP－2）；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）；鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

隨著年齡的增加，骨骼肌質(zhì)量（II肌纖維為主）減少，力量下降，即肌肉衰減征（sarcopenia）已為多數(shù)研究證實(shí)，這種肌肉衰減征嚴(yán)重影響了骨骼肌的機(jī)能和表現(xiàn)。在肌細(xì)胞水平上，肌肉衰減征主要表現(xiàn)為肌纖維數(shù)量的減少，尤其以II型肌纖維為主［6］。作為有絲分裂后的細(xì)胞，肌纖維的再生依賴于未分化的肌源性祖細(xì)胞－骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞［22］。出生后，衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化，為發(fā)育的骨骼肌提供所需的肌細(xì)胞核。成熟的骨骼肌中，衛(wèi)星細(xì)胞處于靜息狀態(tài)。當(dāng)肌纖維受到損傷時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞被激活，隨后增殖、分化，融合成新的肌纖維更換損傷的肌纖維或肌細(xì)胞核［13，22］。骨骼肌正常的活動(dòng)中，細(xì)微的肌纖維損傷是習(xí)以為常的，特別是隨著年齡的增長(zhǎng)［8］，因此，貫穿整個(gè)生命活動(dòng)，需要不斷供給骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞以修復(fù)和維持骨骼肌纖維的正常。目前的研究結(jié)果表明，老年個(gè)體骨骼?、蛐图±w維萎縮伴隨著Ⅱ型肌纖維內(nèi)衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的減少［32］。因此，隨著年齡的增長(zhǎng)，衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量減少可能在肌肉衰減征的發(fā)生過程中起到重要作用。目前的研究證實(shí)了HGF和NO在衛(wèi)星細(xì)胞激活信號(hào)通路上的關(guān)鍵作用［29］。這些研究主要通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽拉衛(wèi)星細(xì)胞或骨骼肌，HGF快速?gòu)钠鋬?chǔ)存部位細(xì)胞外基質(zhì)釋放并與衛(wèi)星細(xì)胞表面受體c－met結(jié)合，從而激活衛(wèi)星細(xì)胞［2，30］。此后的研究發(fā)現(xiàn)，HGF的釋放依賴衛(wèi)星細(xì)胞或肌纖維上的nNOS生成的NO，NO通過上調(diào)MMPs活性介導(dǎo)了HGF的釋放［38］。最近的研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)的骨骼肌質(zhì)量和肌細(xì)胞核的增加伴隨著衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和激活狀態(tài)的增加［19，25］。因此，本研究擬對(duì)耐力運(yùn)動(dòng)、力量運(yùn)動(dòng)和耐力、力量混合型運(yùn)動(dòng)干預(yù)后骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞激活信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因進(jìn)行檢測(cè)，以期了解運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞激活過程中的關(guān)鍵因素，并進(jìn)一步探討不同訓(xùn)練方式激活靜息狀態(tài)衛(wèi)星細(xì)胞的能力，從而有利于我們?cè)O(shè)計(jì)出更好的骨骼肌發(fā)育和修復(fù)方案，以應(yīng)用到運(yùn)動(dòng)科學(xué)（提高運(yùn)動(dòng)員機(jī)能表現(xiàn)）和健康科學(xué)（特別是肌肉萎縮和肌肉衰減征的防治方法）上。

1 材料和方案

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物分組

購(gòu)買3月齡雄性C57BL／6小鼠32只。分籠飼養(yǎng)，每籠1只，每日自由飲水進(jìn)食，喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自然光照，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21℃±2℃。所有C57BL／6小鼠經(jīng)過1周適應(yīng)性飼養(yǎng)并進(jìn)行3天適應(yīng)性訓(xùn)練，隨后進(jìn)行隨機(jī)分組。安靜組、耐力訓(xùn)練組、力量訓(xùn)練組和混合訓(xùn)練組各8只。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

耐力訓(xùn)練組使用由跑臺(tái)改裝成的動(dòng)物跑臺(tái)進(jìn)行無負(fù)重跑臺(tái)訓(xùn)練，1～10周速度為0.8～0.9km／h，11～20周速度為0.9～1.0km／h，21～28周為1.0km／h（表1）；以小鼠尾部負(fù)重爬梯方式建立力量運(yùn)動(dòng)模型，起始負(fù)重量為10%BW，隨后逐漸增加并摸索適宜的負(fù)重重量、爬梯重復(fù)次數(shù)及每組訓(xùn)練的時(shí)間間隔（表2），爬梯高1m，臺(tái)階間隔為2cm，與地面成85°傾斜；混合訓(xùn)練組為耐力與力量混合的訓(xùn)練模式（表3）。

表1 本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耐力組訓(xùn)練方案一覽表Table 1 Proposal of Endurance Training

表2 本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物力量組訓(xùn)練方案一覽表Table 2 Proposal of Strength Training

表3 本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物混合組訓(xùn)練方案一覽表Table 3 Proposal of Mixing Type Training

1.3 取材

末次訓(xùn)練后禁食，常規(guī)飲水，24h后，給C57BL／6小鼠稱重后斷頸處死。迅速取完整右側(cè)脛骨前肌，用濾紙吸取血液后，置于稱量紙上，稱量肌肉質(zhì)量。PBS緩沖液沖洗后，放入標(biāo)記好的1.5ml離心管中，放入液氮凍存0.5h后，轉(zhuǎn)移至－80℃超低溫冰箱，待檢測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)nNOS、HGF、c－met及MMP－2的基因轉(zhuǎn)錄水平

1.4.1 總RNA提取和鑒定

取完整脛骨前肌，按Trizol（Invitrogen）說明書抽提RNA。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的OD260／OD280比值，DEPC水做空白調(diào)零。取RNA樣品于石英比色皿中，加入DEPC水進(jìn)行稀釋，混勻后放于比色室，記錄樣品在260nm和280nm波長(zhǎng)處的吸收值，并計(jì)算OD260／OD280比值。

1.4.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取RNA5μl，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）配制RT反應(yīng)液（總體積為10μl），逆轉(zhuǎn)錄后得cDNA模板。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real－time PCR）

Realtime PCR反應(yīng)體系為20μl，其中，SYBR green PCR Master Mix（TOYOBO）10μl，前向、反向引物各1μl，dH2O 6μl，cDNA模板2μl。反應(yīng)條件，Step 1：預(yù)變性（95℃，60s）；Step 2：（95℃，15s；55℃／56℃，30s；72℃，35s）× 40個(gè)循環(huán)；Step 3：建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，再變性（95℃，30s），退火（55℃／56℃，35s），然后，從55℃／56℃緩慢加熱到（95℃，15s）；每1℃收集熒光一次。經(jīng)儀器自動(dòng)分析，各基因融解曲線（Melt Curve）均為單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)公式2－ΔCt（△CT＝CT－target－CTGAPDH）計(jì)算各樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表4 本研究各基因引物序列一覽表Table 4 Sequences and Details of Target Genes

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的表示方法為。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel 2003處理，使用單因素方差分析不同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組與安靜組差異顯著性，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析不同運(yùn)動(dòng)組間差異顯著性，P＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.01為極顯著差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 體重以及骨骼肌濕重變化

2.1.1 C57BL／6小鼠體重

3月齡小鼠初始體重為24.4±0.827g，各組無顯著性差異。各組小鼠體重隨年齡均有所增加，與實(shí)驗(yàn)前相比有極顯著差異（P＜0.01，圖1）。處死前，C組小鼠體重顯著高于E、S和M組，且具極顯著性差異（P＜0.01，表5）。

圖1 本研究各組小鼠體重隨時(shí)間變化趨勢(shì)示意圖Figure 1. Weight of Mice in Each Group

2.1.2 骨骼肌濕重與體重的比值

M組脛骨前肌質(zhì)量與體重比值非常顯著高于C組（P＜0.01），E組和S組脛骨前肌質(zhì)量與體重比值顯著高于C組（P＜0.05，表6）。

表5 本研究各組小鼠處死前體重統(tǒng)計(jì)一覽表Table 5 Weight of Mice in Each Group

表6 本研究各組小鼠脛骨前?。═A）與體重比值比較一覽表Table 6 Ratio of Tibialis Anterior to Weight in Each Group

注：＊表示與C組比較具有顯著性差異（P＜0.05）；＊＊表示與C組比較具有極顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 各組骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞激活信號(hào)通路中各基因熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

表7顯示，E組、S組與C組相比，nNOS mRNA表達(dá)增加，具有極顯著性差異（P＜0.01）；M組與C組相比，nNOS mRNA表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）；與C組相比，S組MMP－2mRNA表達(dá)增加，有極顯著性差異（P＜0.01）；E組、M組與C組相比，MMP－2mRNA表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）；S組與M組相比，MMP－2mRNA表達(dá)增加，且具有顯著性差異（P＜0.05）；E組與C組相比，脛骨前肌HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量有所增加，具有極顯著性差異（P＜0.01）；S組與C組相比，HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量亦增加，且具極顯著性差異（P＜0.01）；M組與C組相比，HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量也增加，并具有顯著性差異（P＜ 0.05）；S組與M組相比，HGF mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，且具有顯著性差異（P＜0.05）；E組c－met mRNA表達(dá)顯著高于C組（P＜0.05），S組c－met mRNA非常顯著高于C組（P＜0.01）；M組與C組相比，c－met mRNA表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）；S組c－met mRNA顯著高于M組（P＜0.05）。

表7 本研究各組小鼠脛骨前肌中nNOS、MMP－2、HGF、c－met mRNA轉(zhuǎn)錄水平一覽表Table 7 nNOS，MMP－2，HGF，c－met mRNA Transcription in Each Group

3 分析與討論

3.1 不同訓(xùn)練方式對(duì)C57BL／6小鼠體重和脛骨前肌濕重的影響

Somerville等研究結(jié)果顯示，C57BL／6小鼠在其6月齡時(shí)，體重和脛骨達(dá)到最大值［28］。在本實(shí)驗(yàn)的研究中，3月齡C57BL／6小鼠體重隨年齡的增長(zhǎng)而增加（圖1），安靜組在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第25周時(shí)體重達(dá)到其最大值；3個(gè)訓(xùn)練組體重變化趨于一致，21周后趨于較穩(wěn)定，體重增加幅度均比安靜組小。處死前，3組運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)的C57BL／6小鼠體重接近，無顯著差異，安靜組平均體重最大，與3組運(yùn)動(dòng)干預(yù)C57BL／6小鼠有極顯著差異。脛骨前肌濕重與處死前體重的比值數(shù)據(jù)顯示：混合訓(xùn)練組比值最大，耐力訓(xùn)練組比值次之，其后是力量訓(xùn)練組，最后為安靜組，且運(yùn)動(dòng)干預(yù)的3組數(shù)值均比安靜組大，且具顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以明顯地控制體重的增加，這可能因運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增強(qiáng)機(jī)體脂質(zhì)代謝有關(guān)。

目前的研究都表明，力量運(yùn)動(dòng)是一種行之有效的促進(jìn)骨骼肌肥大、增強(qiáng)骨骼肌質(zhì)量的方法，而耐力運(yùn)動(dòng)則通過減少體脂對(duì)去脂體重產(chǎn)生較大的影響。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組小鼠骨骼肌質(zhì)量與體重比明顯高于安靜組，均具有顯著性差異。這種結(jié)果可能是由于運(yùn)動(dòng)干預(yù)組脛骨前肌適應(yīng)性肥大或去脂體重增加，安靜組由于缺乏運(yùn)動(dòng)體內(nèi)脂肪積累過多，兩個(gè)原因?qū)е略摻Y(jié)果的產(chǎn)生。

3.2 不同訓(xùn)練方式對(duì)C57BL／6小鼠脛骨前肌nNOS mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

NO是一個(gè)非常小的分子，可以通過細(xì)胞膜自由擴(kuò)散，在分子水平上發(fā)揮其生理作用，如調(diào)控血壓、免疫調(diào)節(jié)、抑制血小板凝聚、傳遞神經(jīng)信息等。骨骼肌、心肌、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞核肝細(xì)胞均具NOS，可以生產(chǎn)NO［9］。目前已確定，3種NOS同工酶，骨骼肌中主要表達(dá)nNOS并與α1－syntrophin（抗肌萎縮蛋白－糖蛋白復(fù)合體），定位在肌膜表面［15］。NO通過HGF激活靜息狀態(tài)下的衛(wèi)星細(xì)胞的信號(hào)作用已在許多研究中得到證實(shí)。

正常情況下，骨骼肌中的NO一般處于非常低的水平，衛(wèi)星細(xì)胞也處于安靜狀態(tài)，在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、負(fù)重、損傷、剪切應(yīng)力或機(jī)械牽拉的刺激下，NOS的表達(dá)或活性增高［31］。Balon等讓大鼠每天跑臺(tái)90min，每10min進(jìn)行1min的沖刺跑，8周后，發(fā)現(xiàn)大鼠趾長(zhǎng)伸肌和比目魚肌nNOS蛋白表達(dá)增多。Wook Song等人的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ischer－344大鼠腓腸肌中，nNOS蛋白表達(dá)隨著年齡的增加呈下降的趨勢(shì)，但經(jīng)過12周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，F(xiàn)ischer－344大鼠腓腸肌和比目魚肌中nNOS蛋白表達(dá)水平具有顯著性提高［35］。McConell［23］等研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)秀的耐力運(yùn)動(dòng)員（˙VO2peak＞58ml· kg／min）股外側(cè)肌中，nNOS蛋白表達(dá)水平與普通個(gè)體相比較多，且具有顯著性差異，但mRNA水平并沒有太大差異，推測(cè)可能因研究對(duì)象數(shù)目較少；普通個(gè)體騎功率自行車進(jìn)行進(jìn)行為期10天耐力運(yùn)動(dòng)，每天45～90min（75% ˙VO2）其間交替進(jìn)行間歇訓(xùn)練（90%VO～100%˙VO2），最后一次訓(xùn)練30min后取樣，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前股外側(cè)肌中，I、Ⅱa、Ⅱx肌纖維中nNOS蛋白表達(dá)水平?jīng)]什么差異，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后在3種肌纖維中nNOS蛋白表達(dá)水平顯著升高。這些研究結(jié)果證實(shí)，耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練持續(xù)時(shí)間夠達(dá)到一定程度或運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度較大，骨骼肌中nNOS蛋白表達(dá)水平就會(huì)增多。力量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)nNOS蛋白表達(dá)水平的研究或文獻(xiàn)較少。在本實(shí)驗(yàn)的研究中，經(jīng)過29周耐力訓(xùn)練，C57BL／6小鼠脛骨前肌中nNOS mRNA表達(dá)水平較安靜組有所增加，且具有極顯著性差異（P＜0.01），與其他學(xué)者研究耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌中nNOS基因表達(dá)影響的結(jié)果相符；力量訓(xùn)練組與安靜組相比也有所增加，并具有極顯著性差異（P＜0.01）；混合訓(xùn)練組與安靜組相比雖有增加的趨勢(shì)，但沒有顯著性差異，說明力量和耐力性訓(xùn)練可以顯著提高nNOS mRNA表達(dá)水平。nNOS mRNA水平的增多可能會(huì)導(dǎo)致nNOS蛋白表達(dá)的增多從而提高骨骼肌中nNOS酶活性，增加NO生成量。

Leiter［16］等研究發(fā)現(xiàn)，雌性C57BL／6小鼠隨著年齡的增長(zhǎng)（6周齡，6、8、10、18月齡），骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)機(jī)械牽拉或NO刺激的反應(yīng)應(yīng)答逐漸減少，機(jī)械牽拉不同年齡階段小鼠趾長(zhǎng)伸肌發(fā)現(xiàn)，6周齡和6月齡小鼠趾長(zhǎng)伸肌中衛(wèi)星細(xì)胞激活的數(shù)量最多，相同強(qiáng)度機(jī)械牽拉刺激對(duì)8月齡小鼠趾長(zhǎng)伸肌中的衛(wèi)星細(xì)胞激活數(shù)量影響也沒達(dá)到顯著性水平，但機(jī)械牽拉同時(shí)，添加NOS底物或NO供體刺激8月齡小鼠趾長(zhǎng)伸肌衛(wèi)星細(xì)胞，激活數(shù)量顯著增加，而18月齡小鼠趾長(zhǎng)伸肌中的衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)這種牽拉刺激或添加NO供體或同時(shí)使用兩種刺激顯得無動(dòng)于衷。已經(jīng)在人體和嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中證實(shí)，隨著年齡的增加，骨骼肌質(zhì)量（Ⅱ肌纖維為主）減少，力量下降，即肌肉衰竭癥（sarcopenia）［27］，骨骼肌中，衛(wèi)星細(xì)胞隨著年齡的增長(zhǎng)更加趨于有絲分裂安靜期。作為衛(wèi)星細(xì)胞激活信號(hào)通路的起始信號(hào)，NO在骨骼肌中的水平升高可能會(huì)促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的激活，本實(shí)驗(yàn)研究耐力或力量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練均可增加nNOS mRNA水平，因?yàn)闆]有做蛋白水平的測(cè)試，只能猜測(cè)nNOS蛋白表達(dá)或酶活性可能因此而增加，提高骨骼肌中NO含量，從而促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的激活。

3.3 不同訓(xùn)練方式對(duì)C57BL／6小鼠脛骨前肌MMP－2 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

骨骼肌機(jī)能和形態(tài)學(xué)上的變化是對(duì)一些病理或生理刺激的應(yīng)答。大部分但不是全部，這些應(yīng)答反應(yīng)都需要細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的重新塑建（降解和再生）。事實(shí)上，骨骼肌對(duì)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)產(chǎn)生的諸多基因的上調(diào)都與細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)聯(lián)?；|(zhì)金屬酶蛋白（MMPs）是一個(gè)鋅依賴的肽鏈內(nèi)切酶大家族，目前，了解較清晰的已有25個(gè)家族成員，均有一個(gè)前肽區(qū)和一個(gè)包含鋅離子的催化區(qū)域。作為肽鏈內(nèi)切酶，其家族成員可以降解數(shù)種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白、彈力蛋白、纖維結(jié)合蛋白、蛋白聚糖等［12］。不同的MMPs在骨骼肌中均有表達(dá)，在骨骼肌再生、發(fā)育及骨骼肌的血管發(fā)生的過程中發(fā)揮重要作用［4］，并證實(shí)大鼠骨骼肌中表達(dá)MMP－2，機(jī)械牽拉可使其轉(zhuǎn)化成52kDa的激活結(jié)構(gòu)［4］。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致的局部缺血或肌肉牽拉，可以影響MMP－2和MMP－9的表達(dá)水平［4］。NO可以直接通過其亞硝基作用MMP，調(diào)節(jié)其活性。此外，有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，NO可以上調(diào)MMP－2和MMP－9的蛋白表達(dá)水平和酶活性。Rullman［26］等通過人類實(shí)驗(yàn)，觀察10天和5周的恒定負(fù)荷伸膝練習(xí)（45min／天，60次／min），10天和5周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與訓(xùn)練前相比，股外側(cè)肌中MMP2mRNA表達(dá)水平明顯升高，MMP－2蛋白活性在訓(xùn)練后10天達(dá)到最高水平，5周后MMP－2蛋白活性略有下降。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)MMP－2蛋白主要表達(dá)在骨骼肌纖維周圍，肌纖維內(nèi)也有表達(dá)，用激光分割肌纖維也觀察到MMP－2的mRNA表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了MMP－2在骨骼肌中的表達(dá)。Koskinen等人研究發(fā)現(xiàn)，大鼠急性下坡跑恢復(fù)過程中，MMP－2mRNA水平明顯升高［20］。Carmeli［10］等人則發(fā)現(xiàn)，不同的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)SD大鼠骨骼肌中MMP－2表達(dá)水平影響不同。兩周的高強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（32m／min）后腓腸肌中MMP－2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，而低強(qiáng)度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（18m／min）與安靜組相比，MMP－2mRNA和蛋白表達(dá)水平并沒有發(fā)生顯著性變化。這些研究均證實(shí)，在非病理的情況下，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以激活骨骼肌中的MMPs。這也就是說，急性運(yùn)動(dòng)或持續(xù)性運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉損傷或重建過程中，通過調(diào)節(jié)MMP－2的表達(dá)水平完成修復(fù)或重塑。在本實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，耐力和混合組脛骨前肌MMP－2mRNA相對(duì)表達(dá)量有所增加，與安靜組相比，無顯著性差異，力量訓(xùn)練組和安靜組相比，MMP－2mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，且具有極顯著性差異，可能是因?yàn)榱α窟\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練產(chǎn)生的牽拉刺激強(qiáng)烈，力量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過重復(fù)提升負(fù)重，對(duì)骨骼肌小肌群進(jìn)行反復(fù)刺激，與耐力性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練相比對(duì)骨骼肌肥大影響顯著從而增加骨骼肌力量，對(duì)骨骼肌的重塑和再建作用較大，從而促進(jìn)MMP－2的表達(dá)增多。本實(shí)驗(yàn)中，耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練屬于低強(qiáng)度的有氧訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)過程中，小鼠骨骼肌損傷的可能性較小，因此，骨骼肌中MMP－2表達(dá)變化不多，這也與Carmeli等的研究結(jié)果相符。

MMPs在運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌重塑發(fā)揮許多作用，除了已經(jīng)證實(shí)的血管發(fā)生作用，相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)研究表明細(xì)胞外基質(zhì)中MMPs裂解分子和連接蛋白的作用大大提高了諸多生長(zhǎng)因子的生物利用率［12］。Rullman等發(fā)現(xiàn)，只需幾分鐘的運(yùn)動(dòng)就可增加血漿和細(xì)胞外液中速率限制的生血管因子VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）［26］。這些都說明，相關(guān)生長(zhǎng)因子在生理情況下儲(chǔ)存在細(xì)胞外基質(zhì)中，其釋放也不需事先轉(zhuǎn)錄和翻譯。因此可以推測(cè)，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的蛋白水解作用介導(dǎo)了儲(chǔ)存在細(xì)胞外基質(zhì)生長(zhǎng)因子的釋放。Yamada等人對(duì)離體培養(yǎng)的大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，NO通過MMPs把HGF從細(xì)胞外基質(zhì)中釋放出來，NO可能通過激活MMPs的酶內(nèi)切活性，裂解與HGF結(jié)合的蛋白聚糖的核心蛋白或氨基葡聚糖鏈，從而將HGF從細(xì)胞外基質(zhì)中釋放出來［38］。雖然目前仍不是很清楚是何種MMPs負(fù)責(zé)HGF的釋放，前期的研究證實(shí)骨骼肌中表達(dá)MMP－2、MMP－3、MMP－7、MMP－9，其中，MMP－2、MMP－3、MMP－9可以裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的核心蛋白［11］。因此，在機(jī)械牽拉激活衛(wèi)星細(xì)胞的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，MMP－2可能參與HGF的釋放，并依賴NO。此外有研究發(fā)現(xiàn)，HGF一般和蛋白聚糖的胞外區(qū)域形成的復(fù)合體從細(xì)胞外基質(zhì)釋放，一起結(jié)合到c－met受體上［1］。事實(shí)上，HGF與部分硫酸乙酰肝素形成的復(fù)合體和單獨(dú)的HGF相比對(duì)c－met有更好的親和力［24］。

綜上所述，MMPs家族在骨骼肌正常生理狀態(tài)下即有表達(dá)，在本實(shí)驗(yàn)的研究中，力量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組與安靜組相比，MMP－2mRNA表達(dá)水平顯著升高，蛋白水平可能也隨之升高，力量運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑和在建的作用較大，并可以因此通過上調(diào)MMP－2的基因表達(dá)，增加HGF生物利用率，促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的激活。

3.4 不同訓(xùn)練方式對(duì)C57BL／6小鼠脛骨前肌HGF mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

早期的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)，IGF－1和FGFs等生長(zhǎng)因子雖然能夠促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，但前提是衛(wèi)星細(xì)胞已經(jīng)處于激活狀態(tài)［24］。TGF－β（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β）和EGF（內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子）等也不能促進(jìn)安靜狀態(tài)下的衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期［17］。截止到目前為止，在對(duì)所有的生長(zhǎng)因子的研究中，HGF是惟一一個(gè)經(jīng)過證實(shí)能激活安靜狀態(tài)下衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)因子。未損傷的骨骼肌中，HGF與細(xì)胞外基質(zhì)主要組成部分蛋白聚糖連接在一起，儲(chǔ)存在肌細(xì)胞外基質(zhì)中，當(dāng)骨骼肌損傷時(shí)，HGF能快速?gòu)募?xì)胞外基質(zhì)釋放出來并與衛(wèi)星細(xì)胞膜上c－met結(jié)合，激活衛(wèi)星細(xì)胞［3］。目前，主要是通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，研究HGF對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活作用，而有關(guān)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)HGF在活體骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞激活作用的相關(guān)文獻(xiàn)或報(bào)道幾乎沒有。在本實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，3種不同的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式使C57BL／6小鼠脛骨前肌HGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平均比安靜組高，且耐力訓(xùn)練組和力量訓(xùn)練組與安靜組相比具有極顯著性差異，混合組和安靜組相比具有顯著性差異。HGF mRNA水平的上升，可能會(huì)導(dǎo)致HGF蛋白表達(dá)的增多，使得細(xì)胞外基質(zhì)中儲(chǔ)存的HGF水平升高，在NO信號(hào)刺激的作用下，HGF釋放增多，從而促進(jìn)激活的衛(wèi)星數(shù)量增加。

雖然眾多的研究證實(shí)，HGF作為惟一一個(gè)能激活衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，但體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過高的HGF水平減少了機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的衛(wèi)星細(xì)胞激活。Wozniak［36］等發(fā)現(xiàn)，機(jī)械牽拉肌原細(xì)胞，同時(shí)，在其培養(yǎng)基中添加高濃度的HGF，機(jī)械牽拉雖然能夠誘導(dǎo)內(nèi)源性HGF從肌纖維外基質(zhì)中釋放并上調(diào)衛(wèi)星細(xì)胞表面c－met表達(dá)水平，激活的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量卻減少了。Wozniak等推測(cè)可能原因是：1）由于高水平的HGF，導(dǎo)致受體c－met脫敏作用；2）細(xì)胞外基質(zhì)pH或HGF與c－met結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生構(gòu)象改變。Yamada［39］等使用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，骨骼肌再生和運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌肥大依賴衛(wèi)星細(xì)胞的激活和安靜狀態(tài)，機(jī)械牽拉誘導(dǎo)HGF釋放引發(fā)衛(wèi)星細(xì)胞激活，隨后myostatin的表達(dá)增多可能作為一種信號(hào)介導(dǎo)了激活衛(wèi)星細(xì)胞返回其安靜狀態(tài)。Yamada［39］研究小組證實(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞激活增殖的過程中，HGF在激活的衛(wèi)星細(xì)胞返回其安靜狀態(tài)可能通過其濃度依賴性負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，即高水平表達(dá)HGF可能上調(diào)myostatin mRNA水平，增加myostatin蛋白的分泌和表達(dá)水平，從而使激活的衛(wèi)星細(xì)胞恢復(fù)其安靜狀態(tài)。該研究提示，HGF可以通過其濃度依賴性負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)。這些研究結(jié)果說明，骨骼肌纖維損傷或運(yùn)動(dòng)刺激下可以通過釋放細(xì)胞外基質(zhì)中的HGF激活衛(wèi)星細(xì)胞，修復(fù)損傷肌纖維或產(chǎn)生適應(yīng)性變化，也可通過調(diào)節(jié)HGF的表達(dá)或釋放水平，使得尚未分化融合的衛(wèi)星細(xì)胞恢復(fù)其安靜狀態(tài)，以維持衛(wèi)星細(xì)胞池自身的數(shù)量。在本實(shí)驗(yàn)的研究中，3種運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式均導(dǎo)致HGF mRNA表達(dá)水平的增多，作為對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練產(chǎn)生的適應(yīng)性變化，骨骼肌纖維外基質(zhì)儲(chǔ)存的HGF蛋白可能也會(huì)同步增多，從而提高激活骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞的潛能。

3.5 不同訓(xùn)練方式對(duì)C57BL／6小鼠脛骨前肌c－met mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

c－met作為HGF受體，是一個(gè)廣泛表達(dá)的異源二聚體受體絡(luò)氨酸激酶，在骨骼肌中以跨膜蛋白的形式結(jié)合在衛(wèi)星細(xì)胞表面［7］。HGF結(jié)合到c－met上使其形成αβ異源二聚體，絡(luò)氨酸自磷酸化形成募集多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中介［5］。一些研究發(fā)現(xiàn)，HGF可通過c－met誘導(dǎo)ERK磷酸化，激活MAPK家族中的p38β／β，同時(shí)，伴隨著衛(wèi)星細(xì)胞的激活，抑制p38β／β可使衛(wèi)星細(xì)胞保持其安靜狀態(tài)，使其與外界信號(hào)刺激隔絕［18，34］。c－met作為HGF受體，同時(shí)，也是衛(wèi)星細(xì)胞的一種標(biāo)記物，很多研究證實(shí)在所有衛(wèi)星細(xì)胞均表達(dá)c－met且不分肌纖維類型，活體實(shí)驗(yàn)也在安靜的和再生的骨骼肌中均檢測(cè)到c－met蛋白，此外，急性損傷的骨骼肌纖維被大量的單核細(xì)胞所包圍且表達(dá)c－met，即意味著c－met同樣可以標(biāo)記MPCs（生肌性祖細(xì)胞）［14］。這些研究表明，c－met可以作為衛(wèi)星細(xì)胞的一種獨(dú)特標(biāo)記物，方便了我們用免疫組織化學(xué)的方法來鑒別衛(wèi)星細(xì)胞。

Wozniak［36］等通過離體培養(yǎng)單根肌纖維模型，研究了c－met在衛(wèi)星細(xì)胞激活過程中的作用和變化，機(jī)械牽拉正常的肌纖維，c－met的表達(dá)增多，在培養(yǎng)基中添加放線菌酮（抑制蛋白質(zhì)合成）也不會(huì)抑制c－met的表達(dá)，證實(shí)c－met和c－fos一樣屬于即刻早期應(yīng)答基因。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨骼肌中c－met影響的相關(guān)文獻(xiàn)或報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，耐力和力量訓(xùn)練均使C57BL／6小鼠脛骨前肌c－met mRNA表達(dá)水增多，且具顯著和極顯著差異，混合訓(xùn)練組雖然與安靜組相比c－met mRNA表達(dá)有所增多，但沒有顯著差異。c－met突變小鼠不能形成正常的骨骼肌群［12］，說明在NO依賴HGF－c－met激活衛(wèi)星細(xì)胞的信號(hào)通路上，c－met重要作用。c－met mRNA表達(dá)水增多可能是單個(gè)衛(wèi)星細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)增多，也可能是衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的增多。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞作用的相關(guān)文獻(xiàn)大都是對(duì)力量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的研究，而有關(guān)耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的很少。Verney等對(duì)人體試驗(yàn)的研究中，讓受試者進(jìn)行下肢耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和上肢力量訓(xùn)練相結(jié)合的一種訓(xùn)練方式，14周以后發(fā)現(xiàn)三角肌和股外側(cè)肌中衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量與訓(xùn)練前相比增加了38%左右，而且這種增加主要發(fā)生在Ⅱ型肌纖維中［33］。耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)的骨骼肌適應(yīng)性反應(yīng)主要是通過改善心肺功能，增加骨骼肌毛細(xì)血管密度和毛細(xì)血管管腔的肥大，可能通過血液循環(huán)為骨骼肌提供豐富的相關(guān)生長(zhǎng)因子，增加衛(wèi)星細(xì)胞的激活數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，nNOS、HGF、c－met mRNA表達(dá)水平在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練尤其是力量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的刺激下均有所增加，可能促使NO依賴HGF－c－met激活衛(wèi)星細(xì)胞的信號(hào)通路的作用增強(qiáng)，從而使得衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖增加，衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量增加。

4 結(jié)論

1.C57BL／6小鼠體重增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定時(shí)，3種運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組體重均顯著低于安靜組，說明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能較好地控制體重的增加。

2.與安靜組相比，3組運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組C57BL／6小鼠脛骨前肌與體重的比值增加。耐力運(yùn)動(dòng)組的增加可能因體內(nèi)脂肪的減少；力量運(yùn)動(dòng)組的增加可能因脛骨前肌適應(yīng)性肥大；混合訓(xùn)練組可能因脛骨前肌適應(yīng)性肥大及體脂的減少。

3.力量訓(xùn)練組上調(diào)C57BL／6小鼠脛骨前肌NOMMP－2－HGF－c－met衛(wèi)星細(xì)胞激活通路各基因轉(zhuǎn)錄水平。推測(cè)力量運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞的激活具有明顯的促進(jìn)作用，在維持骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞池的數(shù)量和促進(jìn)骨骼肌肥大中具有顯著意義。

4.耐力訓(xùn)練組上調(diào)C57BL／6小鼠脛骨前肌NOMMP－2－HGF－c－met衛(wèi)星細(xì)胞激活通路中nNOS、HGF、cmet基因轉(zhuǎn)錄水平，推測(cè)耐力運(yùn)動(dòng)也能促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的激活，在防止骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的減少，維持骨骼肌質(zhì)量和力量上，也有其可取之處。

5.混合訓(xùn)練組對(duì)C57BL／6小鼠脛骨前肌NO－HGF－cmet衛(wèi)星細(xì)胞激活通路基因轉(zhuǎn)錄水平影響較小，僅HGF表達(dá)水轉(zhuǎn)錄的上調(diào)達(dá)到顯著水平。在本研究中，混合運(yùn)動(dòng)的效果并不是預(yù)期所設(shè)想的耐力和力量運(yùn)動(dòng)效果的疊加，提示在維持衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和促進(jìn)骨骼肌肥大上應(yīng)考慮運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、時(shí)間和頻率，合理安排耐力和力量運(yùn)動(dòng)。

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The Effects of Endurance，Strength and Mixing Type Training on Satellite Cell Activation Signaling Pathway in Adult C57BL／6Mouse Skeletal Muscle

CHEN Tao，CHEN Cai－zhen，LU Jian

Objective：To investigate the effect of endurance，strength and mixing type training on satellite activation.Methods：32three－month－old male C57BL／6mice were randomly distributed into four groups：sedentary（C，n＝8），endurance training（E，n＝8），strength training（S，n＝8），mixing type training（M，n＝8）.After 28weeks exercise intervening，quantitative real－time PCR method is used to detect nNOS，MMP－2，HGF，c－met mRNA expression in tibialis anterior muscles.Results：1）Compared with the controls，tibialis anterior and the weight ratio increases in three types of exercise training.2）Endurance training significantly increased nNOS，HGF，c－met mRNA transcription except MMP－2mRNA.3）Strength training significantly increased nNOS，MMP－2，HGF，c－met mRNA transcription.4）Mixing type training significantly increased HGF mRNA transcription，but had no apparent effect on nNOS，MMP－2，HGF，c－met mRNA transcription.Conclusion：Strength training plays an important role in satellite cell activation，which may be important in maintaining the number of satellite cell pool and promoting extensive skeletal muscle hypertrophy.Endurance training can also promote the activation of satellite cells and would also have its merits in the prevention the number of satellite cells reduction and maintenance skeletal muscle mass and strength.The mixed type training cannot play a composite effect of endurance and strength training in the activation process of satellite cell.It suggested that we should consider the intensity，time and frequency when we arrange endurance and strength training to sustain the number of skeletal muscle satellite cells and promote muscle hypertrophy.

satellitecell；endurancetraining；strengthtraining；mixingtypetraining；Sarcopenia；neuronalnitricoxidesynthase（nNOS）；matrixmetalloproteinase－2（MMP－2）；hepatocytegrowthfactor（HGF）

1000－677X（2011）09－0069－08

2011－03－28；

2011－08－10

上海市浦江人才計(jì)劃資助項(xiàng)目（10PJC029）。

陳濤（1984－），男，安徽臨泉人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與健康，E－mail：chentwhy＠gmail.com；陳彩珍（1967－），女，福建上杭人，教授，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生物化學(xué)，E－mail：caizhenchen＠163.com；盧?。?962－），男，四川綿陽人，教授，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與衰老，E－mail：jlu＠tyxx.ecnu.edu.cn。

華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海200241

East China Normal University，Shanghai 200241，China.

G804.7

A