宋占蘭鄭喜群劉曉蘭

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

Alcalase酶解高底物濃度玉米蛋白工藝優(yōu)化

宋占蘭1，2鄭喜群1，2劉曉蘭1，2

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

以玉米蛋白粉為原料，研究底物濃度、加酶量、水解液pH值和水解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物水解度、可溶性蛋白含量、抗氧化活力和蛋白轉(zhuǎn)換率的影響。首先將玉米蛋白粉順次進(jìn)行堿洗、α－淀粉酶去淀粉和高溫蒸煮預(yù)處理，以破壞蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)和去除淀粉，然后以堿性蛋白酶Alcalase為生物催化劑進(jìn)行玉米蛋白（10%～15%，m∶V）的限制性水解。結(jié)果表明，最適酶解條件：底物濃度13.5% （m∶V），加酶量2%，水解溫度68℃，反應(yīng)體系pH值7.7，總水解時(shí)間210min。在上述條件下，蛋白水解度為28.81%，水解液的可溶性蛋白含量為31.69mg/mL，水解物抗氧化活性為547.83U/mL，蛋白轉(zhuǎn)化率為36.92%。獲得的玉米蛋白水解物的溶解性顯著增加，具有良好的抗氧化活性，顯示了其在食品和藥品等行業(yè)應(yīng)用的潛力和前景。

玉米蛋白粉；堿性蛋白酶；水解度；可溶性蛋白；抗氧化活性；蛋白轉(zhuǎn)化率

以玉米為原料采用濕法生產(chǎn)淀粉時(shí)，可以分離出玉米干基6%左右的副產(chǎn)物——玉米黃粉（corn gluten meal，CGM；又稱玉米蛋白粉）。玉米黃粉中約含62%～71%的蛋白質(zhì)，其余是20%的淀粉和約13%的纖維素，還含有15種無機(jī)鹽以及玉米獨(dú)有的黃色素［1］。玉米黃粉中的蛋白質(zhì)主要由玉米醇溶蛋白（zein，65%～68%）和谷蛋白（glutelin，22%～23%）組成，還有少量的球蛋白（globulins，1.2%）和白蛋白（albumin）。蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)性和功能性均取決于其氨基酸組成和結(jié)構(gòu)。從營(yíng)養(yǎng)性角度講，玉米黃粉中的蛋白質(zhì)不是人類理想的蛋白質(zhì)，因?yàn)橛衩S粉中含人體必須的賴氨酸、色氨酸量少，而疏水性氨基酸量多，造成氨基酸組成不平衡，這種不平衡的氨基酸組成限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。蛋白質(zhì)的功能性必須在其具有良好的水溶性的前提下才能充分表現(xiàn)出來，蛋白質(zhì)功能的改變基本上都是由于其結(jié)構(gòu)的改變?cè)斐傻模捎酶淖兊鞍捉Y(jié)構(gòu)的加工方法或蛋白酶解技術(shù)可以將其功能特性釋放出來［2］。改性后的玉米蛋白不僅具有良好的溶解性、流動(dòng)性、熱穩(wěn)定性，還具有降血壓、抗氧化［3］、促酒精代謝等生理活性。本試驗(yàn)針對(duì)玉米蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用堿處理、去淀粉和高溫蒸煮依次處理玉米黃粉，再結(jié)合Alcalace蛋白酶解技術(shù)對(duì)高底物濃度玉米蛋白酶解規(guī)律進(jìn)行初探。高底物濃度玉米蛋白酶解所需的設(shè)備容量小，設(shè)備利用率高。本試驗(yàn)旨為玉米蛋白酶法修飾的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米黃粉：黑龍江省青岡縣淀粉廠；

Alcalase堿性蛋白酶：酶活為2.7×105U/g，丹麥 NovoNordisk公司；

α－淀粉酶：酶活為2 850U/g，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；

其他試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

紫外－可見分光光度計(jì)：TU1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

貝克曼紫外－可見分光光度計(jì)：DU800，貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司；

凱氏定氮儀：消化系統(tǒng)K437，蒸餾系統(tǒng)B324，瑞士Buchi公司；

低速離心機(jī)：TGL－16G，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

pH計(jì)：PB－10，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米黃粉預(yù)處理方法

（1）堿處理：用濃度為4%的NaCO3溶液處理玉米黃粉，添加量為16mL/g，在40℃恒溫水浴鍋中處理10min，去除NaCO3溶液后按固液比1∶15（m∶V）加冷水?dāng)嚢柘礈煊衩S粉10min，洗去殘留的NaCO3溶液后，溶液于3 000r/min離心20min，去除上清液，沉淀于60℃恒溫干燥箱中烘干、研磨、備用［4］。

（2）去淀粉：用pH 6.0的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液配制成濃度為10%的堿處理后的玉米黃粉溶液，α－淀粉酶加酶量為30U/g，溫度40℃，處理2h，反應(yīng)結(jié)束后酶解液在100℃ 滅酶20min，過濾去除淀粉水解產(chǎn)物，殘?jiān)儆猛康恼麴s水洗滌3次，以徹底去除淀粉水解的產(chǎn)物。酶解液于3 000r/min離心20min，去除上清液，沉淀于60℃恒溫干燥箱中烘干、研磨、備用［5］。

（3）高溫蒸煮：將堿處理、去淀粉處理后的玉米黃粉進(jìn)行高溫蒸煮，蒸煮壓力為0.1MPa，蒸煮時(shí)間為30min，料液比≥1∶2.5（m∶V）。蒸煮后玉米黃粉于60℃恒溫干燥箱中烘干、研磨、備用［6］。

1.3.2 堿性蛋白酶Alcalase水解高底物濃度玉米蛋白粉的條件優(yōu)化 將預(yù)處理后的玉米黃粉按一定底物濃度用pH 8.5的50mmol/L的Tris－HCL緩沖液配制成玉米黃粉溶液［3］，加入一定量的Alcalase堿性蛋白酶，在一定的溫度和pH條件下，在恒溫振蕩水浴中進(jìn)行酶水解反應(yīng)120min，每隔一定時(shí)間用pH－滴定法測(cè)定玉米蛋白水解度，并在此相應(yīng)時(shí)間間隔分別取酶解液，酶解液立即于100℃ 沸水中加熱20min以鈍化酶活力，在3 000r/min離心20min，測(cè)定上清液中可溶性蛋白含量和抗氧化活性。

（1）單因素試驗(yàn)：主要考察水解溫度、酶解液pH、底物濃度和加酶量對(duì)酶催化水解反應(yīng)的影響。

（2）正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)［7］，確定Alcalase堿性蛋白酶催化的最佳水解條件。

（3）確定最佳酶解時(shí)間：在最佳水解條件下酶解，確定適宜酶解時(shí)間，同時(shí)測(cè)定最佳酶解條件下酶解物的最終水解度、可溶性蛋白含量、抗氧化活性以及蛋白轉(zhuǎn)化率。

1.4 分析方法

1.4.1 水解度的測(cè)定 pH－Stat法［8］。

1.4.2 可溶性蛋白含量的測(cè)定 Folin－酚法［9］，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4.3 抗氧化活性的測(cè)定 改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法——微量進(jìn)樣法［10］。

1.4.4 可溶性蛋白轉(zhuǎn)化率的測(cè)定 取水解、離心后得到的蛋白水解液15mL，加入10%的三氯乙酸（TCA）15mL，混合均勻靜置30min，于4 000r/min離心10min，取離心后的上清液10mL消化并進(jìn)行凱氏定氮，測(cè)定可溶性蛋白轉(zhuǎn)化率［11］。

式中：

P——可溶性蛋白轉(zhuǎn)化率，%；

X——酶解液中溶于10%TCA的氮含量，g；

X0——未酶解前溶于10%TCA的氮含量，g；

S0——底物蛋白質(zhì)的總氮含量，g。

1.4.5 總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 微量凱氏定氮法［12］。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)Alcalase水解玉米蛋白的影響 溫度對(duì)玉米蛋白的水解有較大的影響［13］。溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響主要是影響反應(yīng)速率常數(shù)，在較低的溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)速率常數(shù)隨著溫度的增加而增加，因而酶反應(yīng)速率增加。但超過一定溫度后，酶發(fā)生熱失活引起酶的催化速率下降。在底物濃度10% （m∶V）、水解液pH 8.5、加酶量3%的條件下，考察溫度分別為55，60，65℃時(shí)對(duì)Alcalase催化水解反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖1～3。

由圖1～3可知，Alcalase堿性蛋白酶在溫度65℃條件下對(duì)玉米蛋白粉的水解效果更明顯，水解度和可溶性蛋白含量都隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，水解120min后，酶解液水解度為24.9%，可溶性蛋白含量為26.36mg/mL，抗氧化活性呈現(xiàn)不規(guī)則的變化，但60min后趨于穩(wěn)定，最終可達(dá)到430.05U/mL。

圖1 溫度對(duì)Alcalase水解玉米黃粉水解度的影響Figure 1 Effect of temperature on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

圖2 溫度對(duì)Alcalase水解玉米黃粉可溶性蛋白的影響Figure 2 Effect of temperature on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

圖3 溫度對(duì)Alcalase水解玉米黃粉抗氧化活性的影響Figure 3 Effect of temperature on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

2.1.2 pH對(duì)Alcalase水解玉米蛋白的影響 水解液的pH值直接影響酶與底物的結(jié)合和催化。玉米蛋白在偏堿的條件下溶解度較高，這是因?yàn)樵诖饲闆r下玉米蛋白發(fā)生了解離，部分玉米蛋白內(nèi)部的親水性集團(tuán)暴露出來，從而提高了玉米蛋白的水溶性［14］。在底物濃度10%（m∶V）、水解溫度60℃、加酶量3%的條件下，考察水解液pH分別為8.0，8.5，9.0時(shí)對(duì) Alcalase催化水解反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4～6。

圖4 pH對(duì)Alcalase水解玉米黃粉水解度的影響Figure 4 Effect of pH on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

圖5 pH對(duì)Alcalase水解玉米黃粉可溶性蛋白含量的影響Figure 5 Effect of pH on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

圖6 pH對(duì)Alcalase水解玉米黃粉抗氧化活性的影響Figure 6 Effect of pH on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

由圖4～6可知，Alcalase堿性蛋白酶在pH為8.0的條件下對(duì)玉米蛋白粉的水解效果更明顯，水解度和可溶性蛋白含量都隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，最高水解度可達(dá)到25.78%，可溶性蛋白含量可達(dá)28.47mg/mL，抗氧化活性呈現(xiàn)不規(guī)則變化，但最終較高，可達(dá)到411.37U/mL。

2.1.3 底物濃度對(duì)Alealase水解玉米蛋白的影響 底物濃度與反應(yīng)速度和產(chǎn)物生成量都有關(guān)系。當(dāng)玉米蛋白底物濃度較小時(shí)，酶相對(duì)過量，底物不足以結(jié)合所有的酶，使得一部分酶未能充分發(fā)揮其作用，隨著底物濃度的增大，過量的酶與底物充分結(jié)合，水解度隨底物濃度的增加而增大，當(dāng)酶完全與底物結(jié)合后，這種增加的趨勢(shì)逐漸減弱。在水解溫度60℃、水解液pH 8.5、加酶量3%的條件下，考察底物濃度分別為10%，13%，15%（m∶V）時(shí)對(duì)Alcalase催化水解反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖7～9。

由圖7～9可知，Alcalase堿性蛋白酶在底物濃度13%（m∶V）條件下對(duì)玉米蛋白粉的水解效果更明顯，水解度隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，最高水解度可達(dá)到27.31%，可溶性蛋白含量可達(dá)27.16mg/mL，抗氧化活性在前40min呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，40min之后趨于穩(wěn)定，可達(dá)到461.54U/mL。

圖7 底物濃度對(duì)Alcalase水解玉米黃粉水解度的影響Figure 7 Effect of concentration of substrate on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

圖8 底物濃度對(duì)Alcalase水解玉米黃粉可溶性蛋白含量的影響Figure 8 Effect of concentration of substrate on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

圖9 底物濃度對(duì)Alcalase水解玉米黃粉抗氧化活性的影響Figure 9 Effect of concentration of substrate on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

2.1.4 加酶量對(duì)Alcalase水解玉米黃粉程度的影響 水解反應(yīng)速度的快慢直接和酶的濃度相關(guān)［15］。當(dāng)加酶量較小時(shí)，隨著加酶量的增加，參與反應(yīng)的酶的分子越多，相應(yīng)的酶解速度就越快。當(dāng)加酶量較大時(shí)，產(chǎn)物積累對(duì)酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制較大，反應(yīng)速率降低。在底物濃度10%（m∶V）、水解液pH 8.5、水解溫度60℃的條件下，考察水解液加酶量分別為1%，2%，3%時(shí)對(duì)Alcalase催化水解反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖10～12。

圖10 加酶量對(duì)Alcalase水解玉米黃粉水解度的影響Figure 10 Effect of rafio of E：S on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

圖11 加酶量對(duì)Alcalase水解玉米黃粉可溶性蛋白含量的影響Figure 11 Effect of rafio of E：S on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

圖12 加酶量對(duì)Alcalase水解玉米黃粉抗氧化活性的影響Figure 12 Effect of c rafio of E：S on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

由圖10～12可知，當(dāng)加酶量（E：S）大于2%時(shí)，玉米蛋白水解度和可溶性蛋白含量隨加酶量的增加其上升的幅度不明顯，而且抗氧化活性有下降趨勢(shì)，再通過增加酶量的方法來提高水解度不會(huì)有顯著的改善。因此，根據(jù)酶成本及生物活性肽的釋放，試驗(yàn)范圍內(nèi)的Alcalase堿性蛋白酶酶解最適加酶量為2%，此時(shí)酶解液水解度為25.59%，可溶性蛋白含量為24.9mg/mL，抗氧化活性呈現(xiàn)不規(guī)則的變化，但90min后逐漸升高，最終可達(dá)到411.37U/mL。

2.2 酶解條件的進(jìn)一步優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)方法，進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件。以玉米黃粉水解度（DH）為指標(biāo)，對(duì)底物濃度（A）、水解溫度（B）、加酶量（C）和pH（D）4個(gè)因素選用四因素三水平試驗(yàn)表L9（34）以確定Alcalase酶解高底物濃度玉米黃粉的最佳條件，L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表見表1，L9（34）正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，方差分析表見表3。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Design and result of orthogonal test of L9（34）

由表2可知，極差分析得出影響Alcalase酶解高底物濃度玉米蛋白酶解物水解度的因素主次順序?yàn)闇囟龋˙）＞底物濃度（A）＞加酶量（C）＞pH（D），最佳組合為 A3B3C2D1。由表3對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明，底物濃度、溫度、加酶量和pH對(duì)水解度的影響均具有顯著性，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?3.5%（m∶V），水解溫度為68℃，加酶量為2%，pH 為7.7，酶解時(shí)間為120min時(shí)，酶解液水解度為26.06%，可溶性蛋白含量為28.40mg/mL，抗氧化活性為338.46U/mL，蛋白轉(zhuǎn)換率為35.27%。

表3 方差分析表?Table 3 Analysis of variance table

2.3 適宜酶解時(shí)間的確定

以水解液可溶性蛋白含量和抗氧化活性為檢測(cè)指標(biāo)，在底物濃度13.5%，水解溫度68℃，加酶量2%，pH值7.7條件下進(jìn)行酶解，考察適宜的水解時(shí)間。結(jié)果見圖13。

圖13 Alcalase玉米黃粉蛋白水解物可溶性蛋白含量和抗氧化活性隨水解時(shí)間的變化Figure 13 The content of soluble protein and antioxidative activity of hydrolysate by Alcalase during hydrolysis

在最適的溫度和pH值條件下，水解物的可溶性蛋白含量隨水解反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在開始水解反應(yīng)的30min內(nèi)，水解物抗氧化活性的增加趨勢(shì)與可溶性蛋白含量一致，30min后開始下降，在反應(yīng)50min時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，隨后抗氧化活性呈不規(guī)則變化，在210min時(shí)抗氧化活性達(dá)到最大值，可溶性蛋白含量也趨于平緩。綜合考慮，蛋白酶Alcalase水解玉米黃粉蛋白適宜的時(shí)間為210min，此時(shí)酶解物水解度為28.81%，可溶性蛋白含量為31.69mg/mL，抗氧化活性為547.83U/mL，蛋白轉(zhuǎn)化率為36.92%。試驗(yàn)結(jié)果與低底物濃度（5%）玉米蛋白酶解［2］進(jìn)行比較可知，酶解物水解度變化不大，但水解物可溶性蛋白含量提高了13.75%，抗氧化活性提高了60.76%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以依次經(jīng)過堿處理、α－淀粉酶去淀粉、高溫蒸煮處理的玉米黃粉為底物，采用Alcalase堿性蛋白酶對(duì)其酶解，通過單因素和正交試驗(yàn)確定了Alcalase堿性蛋白酶的最適酶解條件。結(jié)果表明：Alcalase堿性蛋白酶水解高底物濃度玉米蛋白的最適酶解條件為底物濃度13.5%（m∶V），水解溫度68℃，加酶量2%，水解液pH 7.7，在此條件下水解210min酶解基本結(jié)束，此時(shí)酶解物水解度為28.81%，可溶性蛋白含量為31.69mg/mL，抗氧化活性為547.83U/mL，蛋白轉(zhuǎn)化率為36.92%。高底物濃度玉米蛋白酶解不但可以提高設(shè)備利用率、節(jié)約成本，而且能夠提高產(chǎn)物的溶解性和抗氧化活性。

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Optimization of hydrolysis condition on high concentration of corn gluten by Alcalase

SONG Zhan－lan1，2ZHENG Xi－qun1，2LIU Xiao－lan1，2

（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar，Heilongjiang161006，China；2.Key Constructive Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province Normal University，Qiqihar，Heilongjiang161006，China）

By using corn gluten meal as raw material，the effects were studied to level of hydrolysis，quantity of dissolve protein，antioxidation ability and ratio of protein conversion from substrate concentration，enzyme addition，hydrolysate pH value，hydrolysis temperature.Firstly，corn gluten meal was conducted through alkali wash，starch removal byα－amylase，and a pretreatment of thermophilic digestion，in order to breakdown higher－order structure of protein and remove starch.Then，Alcalase，which was used as biocatalyst，was to hydrolyze corn gluten meal（10%－15%，m∶V）.The effects of substrate concentration，enzyme addition content，pH，and tempera－ture on degree of hydrolysis，were investigated.The content of soluble protein，antioxidative activity，and the ratio of protein conversion were investigated.The best hydrolysis results was obtained by conducting the hydrolysis at 68 ℃ with substrate concentration 13.5%（m∶V），enzyme addition 2%，pH 7.7and 210min.Under the optimal condition，degree of hydrolysis of corn gluten meal reached 28.81%，the content of soluble protein of hydrolysates was 31.69mg/mL，antioxidative activity was 547.83U/mL，and the ratio of protein conversion reached 36.92%.The solublity of the hydrolysates increased significantly and displayed good antioxidative activity.The results indicated that the hydrolysates had potential and promising application in the filed of food and medicines industry.

corn gluten；alcalase；hydrolyzing degree；soluble protein；antioxidant activity；protein conversion rate

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.061

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：31071629）；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：B200919）

宋占蘭（1986－），女，齊齊哈爾大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：libaosheng521＠126.com

鄭喜群

2011－08－01