王成濤 丁曉英 張佳嬋 趙 磊 孫寶國

（1.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

非水相介質(zhì)雜醇油酶法轉(zhuǎn)化天然酯類香料的研究

王成濤 丁曉英 張佳嬋 趙 磊 孫寶國

（1.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

為提高雜醇油的利用率和附加值，研究非水相條件下雜醇油的脂肪酶催化酯化反應(yīng)，優(yōu)化其轉(zhuǎn)化為天然酯類香料的工藝條件。結(jié)果表明，酶用量、分子篩用量、乙酸加入次數(shù)及間隔時間、搖床轉(zhuǎn)速、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等因素條件對產(chǎn)物酯的生成有重要影響，采用間歇式加酸、加入適量分子篩吸水劑可明顯提高混合酯得率。在正己烷10mL、雜醇油3mL、乙酸1.5mL的反應(yīng)體系中，正交試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化后的工藝條件（乙酸異戊酯產(chǎn)率最高時）：脂肪酶Novozym 435FG用量70mg、乙酸分6次加入、加入乙酸間隔時間3h、分子篩用量2g、搖床轉(zhuǎn)速140r/min、反應(yīng)溫度45℃、反應(yīng)時間36h。該條件下，乙酸異戊酯、乙酸異丁酯和乙酸丙酯的產(chǎn)率分別為90.1%，91.3%，78.1%。

雜醇油；脂肪酶；非水相；酶法轉(zhuǎn)化；天然酯類香料

雜醇油是以生物質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精的副產(chǎn)物，主要成分為異戊醇（約含45%）、異丁醇、丙醇等［1］。目前，中國對雜醇油的利用主要有兩條途徑［2］：① 雜醇油經(jīng)精制分餾得到C2～C3低碳混合醇、C4醇和異戊醇，作為燃料或溶劑等。② 硫酸催化酯化雜醇油制備混合酯。利用相轉(zhuǎn)移催化劑、濃硫酸進(jìn)行酯化反應(yīng)，需要在80℃以上，濃硫酸具有強(qiáng)烈腐蝕性，易腐蝕生產(chǎn)設(shè)備，不符合環(huán)境友好生產(chǎn)的要求。

非水相酶催化是指生物酶在非水介質(zhì)中進(jìn)行的催化反應(yīng)。1986年Klibanov［3］發(fā)表了關(guān)于有機(jī)介質(zhì)中酶催化的條件和特點(diǎn)。近30年來，非水相酶催化研究取得較大進(jìn)展，非水相體系中生物酶催化合成短鏈酯、糖酯、肽、手性醇、葡萄糖苷、生物柴油等研究［4－11］都取得了重大突破。本試驗(yàn)以雜醇油和發(fā)酵乙酸為主要原料，以篩選出的脂肪酶Novozym 435FG為催化劑，研究正己烷反應(yīng)體系中反應(yīng)因素條件對產(chǎn)物酯產(chǎn)率的影響，優(yōu)化其轉(zhuǎn)化工藝條件，為雜醇油的綜合利用，提高其附加值提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸丙酯、乙酸、正己烷：AR級，國藥化學(xué)試劑公司；

脂肪酶 Novozym 435FG：來源于 Candida Antarctica B型脂肪酶；

有機(jī)相濾膜：孔徑0.45μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

雜醇油：山東裕方生物化工有限公司；

去離子水、高純水：本實(shí)驗(yàn)室自制；

高速臺式離心機(jī)：TGL－10C，上海安亭科學(xué)儀器廠；

恒溫?fù)u床：HQ45，中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF－101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

氣相色譜－質(zhì)譜儀：6890N－5975C，安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 酯類香料的生成條件 在正己烷10mL、雜醇油3mL、乙酸1.5mL的反應(yīng)體系中，研究脂肪酶Novozym 435FG用量、乙酸加入次數(shù)、乙酸加入間隔時間、分子篩用量、搖床轉(zhuǎn)速、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等反應(yīng)條件對混合酯產(chǎn)率的影響。一次性注射器吸取1.5mL反應(yīng)體系上清液，0.45μm濾膜過濾，吸取100μL、正己烷定容至5mL容量瓶，氣－質(zhì)聯(lián)機(jī)測定產(chǎn)物酯含量［4］。

1.2.2 氣－質(zhì)聯(lián)機(jī)測定產(chǎn)物酯的色譜條件 DB－WAX毛細(xì)管色譜柱（60×0.320×0.25），進(jìn)樣器溫度250℃，進(jìn)樣量1.0μL，檢測器溫度250℃；柱溫在60℃保持3min，以3℃/min升至90℃，以20℃/min上升到230℃，保持3min，共計23.5min；載氣為氦氣，總流量4.6mL/min，壓力為1.101×105Pa。

1.2.3 酯類香料的產(chǎn)率 以乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸丙酯為對照品（為外標(biāo)物），氣－質(zhì)聯(lián)機(jī)測定酯含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；氣－質(zhì)聯(lián)機(jī)測定各反應(yīng)條件下產(chǎn)物酯含量，計算其產(chǎn)率［4］。

式中：

R——酯類香料的產(chǎn)率，%；

C1——產(chǎn)物乙酸異戊酯（或乙酸異丁酯或乙酸丙酯）的濃度，mg/mL；

M1——異戊醇（或異丁醇或正丙醇）的摩爾質(zhì)量，g/mol；

M2——乙酸異戊酯（或乙酸異丁酯或乙酸丙酯）的摩爾質(zhì)量，g/mol；

a——異戊醇（或異丁醇或正丙醇）所占比例；

b——正己烷反應(yīng)體系體積，b＝14.5mL。

1.2.4 固定化脂肪酶的回收 將含脂肪酶的反應(yīng)液進(jìn)行常壓過濾，取出脂肪酶，用正己烷沖洗并且常溫干燥。如此反復(fù)2次，置于冰箱內(nèi)冷藏保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 雜醇油轉(zhuǎn)化酯類香料工藝條件的單因素試驗(yàn)

在正己烷10mL、雜醇油3mL、乙酸1.5mL的反應(yīng)體系中，選擇Novozym 435FG用量70mg、乙酸分5次加入，乙酸加入間隔時間3h、分子篩用量2g、搖床轉(zhuǎn)速140r/min、反應(yīng)溫度45℃、反應(yīng)時間30h等7種因素條件，分別以其中之一為變量，固定其它參數(shù)，研究反應(yīng)因素條件對混合酯產(chǎn)率的影響，其結(jié)果見圖1～7。

圖1 正己烷反應(yīng)體系中脂肪酶用量對酯產(chǎn)率的影響Figure 1 Effect of lipase content on the ester yield rates in hexane reaction system

圖2 正己烷反應(yīng)體系中分子篩用量對酯產(chǎn)率的影響Figure 2 Effect of molecular sieve dosage on the ester yield rates in hexane reaction system.

圖3 正己烷反應(yīng)體系中乙酸加入次數(shù)對酯產(chǎn)率的影響Figure 3 Effect of added times of acetic acid on the ester yield rates in hexane reaction system.

2.1.1 脂肪酶用量對混合酯產(chǎn)率的影響 由圖1可知，當(dāng)反應(yīng)體系中脂肪酶用量為70mg，乙酸丙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯的產(chǎn)率達(dá)到峰值；在較低脂肪酶用量時，雜醇油與乙酸反應(yīng)的速率和產(chǎn)率是隨著脂肪酶Novozym 435FG的增加而不斷增加，超過一定范圍后繼續(xù)增加酶用量，產(chǎn)率提高并不明顯，這與常見水相的酶促反應(yīng)體系中表現(xiàn)是一致的。但研究也發(fā)現(xiàn)，非水相脂肪酶酯化反應(yīng)體系中，適當(dāng)?shù)暮渴蔷S持脂肪酶空間構(gòu)想、反應(yīng)活性所必需的；過量增加酶用量，由于酶本身之間爭奪必需水的競爭作用增強(qiáng)，會影響非水相催化反應(yīng)的速率和酶催化活性。Sabeder等［5］研究果糖酯合成時也發(fā)現(xiàn)，非水相中脂肪酶過量增加，反而會使產(chǎn)物生成量下降，甚至反應(yīng)停止。因此選擇70mg脂肪酶作為后續(xù)試驗(yàn)的反應(yīng)條件。

圖4 正己烷反應(yīng)體系中乙酸加入間隔時間對酯產(chǎn)率的影響Figure 4 Effect of time interval of acetic acid on the ester yield rates in hexane reaction system

圖5 正己烷反應(yīng)體系中搖床轉(zhuǎn)速對酯產(chǎn)率的影響Figure 5 Effect of shaker speed on the ester yield rates in hexane reaction system

圖6 正己烷反應(yīng)體系中反應(yīng)溫度對酯產(chǎn)率的影響Figure 6 Effect of reaction temperature on the ester yield rates in hexane reaction system

圖7 正己烷反應(yīng)體系中反應(yīng)時間對酯產(chǎn)率的影響Figure 7 Effect of reaction time on the ester yield rates in hexane reaction system

2.1.2 分子篩用量對混合酯產(chǎn)率的影響 酯化反應(yīng)是有水生成的可逆反應(yīng)，且適當(dāng)水量是非水相環(huán)境下脂肪酶保持活力所需。如果生成水不能有效移除，不僅會影響酯化反應(yīng)進(jìn)程，而且還會改變非水相條件下脂肪酶微環(huán)境，酶活性會降低甚至完全失活，降低酯得率［6］。分子篩是一種良好除水劑。由圖2可知，隨著分子篩用量的增加，混合酯產(chǎn)率逐漸增加，當(dāng)分子篩用量為2g時，其酯產(chǎn)率達(dá)到最大值；添加分子篩過量時，反應(yīng)體系中水分基本完全除去，會降低酶的柔性，導(dǎo)致酶活力降低、喪失。因此，分子篩用量2g作為后續(xù)反應(yīng)條件。

2.1.3 乙酸加入次數(shù)對混合酯產(chǎn)率的影響 非水相脂肪酶催化反應(yīng)體系中需要適當(dāng)?shù)乃?，由于底物乙酸的pH值低，過多的乙酸會降低脂肪酶的活性。圖3比較了恒定乙酸用量、一次性或間歇分批加入乙酸對混合酯生成率的影響。乙酸一次性加入時，3種產(chǎn)物酯的生成量基本維持在40%～55%，即使延長反應(yīng)時間至48h，產(chǎn)物生成量的增加也不明顯；分批次慢慢向系統(tǒng)中加入乙酸，混合酯產(chǎn)率有明顯上升，當(dāng)乙酸分5次以上加入時產(chǎn)率基本達(dá)到峰值。由此可見，在低pH環(huán)境下，乙酸的強(qiáng)酸性及pH值影響了反應(yīng)體系的微環(huán)境，進(jìn)而影響和改變了脂肪酶的空間結(jié)構(gòu)與酶活性，使酶的活性位點(diǎn)被“蓋”起來，導(dǎo)致酶活性降低［7］。分批加入底物乙酸，有利于緩解低pH值作用，最大限度的提高酯產(chǎn)率。Romeroa等［4］在研究酶法合成乙酸異戊酯時發(fā)現(xiàn)過多乙酸或者乙酸酐用量會降低脂肪酶活性，采用過量異戊醇可緩解此類問題。因此，選擇乙酸加入量為5次作為后續(xù)的反應(yīng)條件。

2.1.4 乙酸加入間隔時間對混合酯產(chǎn)率的影響 在恒定乙酸用量、乙酸分5次加入的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)研究了乙酸加入間隔時間對酯產(chǎn)率的影響（圖4）。結(jié)果表明隨著乙酸加入間隔時間的增加，混合酯產(chǎn)率也是呈線性增加，當(dāng)間隔時間≥3h，產(chǎn)率基本保持不變，因此選擇乙酸加入間隔時間為3h。

2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)率的影響 在酶促酯化反應(yīng)中底物的傳質(zhì)會對反應(yīng)有一定影響，搖床轉(zhuǎn)速表現(xiàn)出對產(chǎn)率有重要影響，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，固定化酶在體系中充分散開，可以使酶分子與反應(yīng)底物充分接觸，提高酶活性位點(diǎn)［8］。由圖5可知，搖床搖速為140r/min時，混合酯產(chǎn)率達(dá)到最大值，約為65%～80%。Romeroa［4］研究了外部傳質(zhì)、內(nèi)部傳質(zhì)的不同?；w對酯合成影響及動力學(xué)，把轉(zhuǎn)速從100r/min調(diào)高至300r/min（外部傳質(zhì)），產(chǎn)物生成量的提高；使用不同粒徑、不同孔徑的固定化酶（內(nèi)部傳質(zhì)），增大轉(zhuǎn)速也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物生成量有所提高，這與本試驗(yàn)得出的結(jié)果基本一致。因此，選擇轉(zhuǎn)速為140r/min。

2.1.6 反應(yīng)溫度對混合酯產(chǎn)率的影響 溫度對酶活性的影響較大，一般固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性都較好，Novozym 435 FG脂肪酶在60℃下仍有很好熱穩(wěn)定性［9］。為防止溫度過高使酶活降低、提高酶使用次數(shù)，研究了30～50℃的反應(yīng)溫度范圍內(nèi)，由圖6可知，在此溫度范圍內(nèi)，混合酯產(chǎn)率曲線較為平緩，約為60%～80%，因此選定正己烷反應(yīng)體系中45℃是較適宜反應(yīng)溫度。

2.1.7 反應(yīng)時間對混合酯產(chǎn)率的影響 在反應(yīng)時間≤30h時（圖7），隨著反應(yīng)時間的增加，混合酯產(chǎn)率持續(xù)增加，因此選擇反應(yīng)時間為30h，其產(chǎn)率為65%～80%。Chowdary等［10］利用異丁酸、異戊醇和Nov435脂肪酶合成異丁酸異戊酯的優(yōu)化條件后的反應(yīng)時間為144h，產(chǎn)率為85%；Macedo等［11］利用產(chǎn)自Geotrichum sp.和Rhizopus sp.的脂肪酶合成丁酸異戊酯的優(yōu)化條件后反應(yīng)時間為48h，產(chǎn)率為75%。

2.2 雜醇油轉(zhuǎn)化酯類香料工藝條件的正交試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，在正己烷10mL、雜醇油3mL、乙酸1.5mL、脂肪酶用量70mg、搖床轉(zhuǎn)速140r/min、反應(yīng)溫度45℃的反應(yīng)體系中，選擇對酯產(chǎn)率影響較大的乙酸加入次數(shù)、乙酸加入間隔時間、反應(yīng)溫度、分子篩用量進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計，進(jìn)一步優(yōu)化其正己烷反應(yīng)體系中工藝條件。正交試驗(yàn)的因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 試驗(yàn)因素與水平Table 1 Experimental factors and levels

由表2可知，4因素對產(chǎn)物酯產(chǎn)率的影響主次順序?yàn)榉磻?yīng)時間（C）＞乙酸加入次數(shù)（A）＞乙酸加入間隔時間（B）＞分子篩添加量（D）；其最優(yōu)條件：正己烷10mL、雜醇油3mL、乙酸1.5mL的反應(yīng)體系中，脂肪酶用量70mg（2.69g/mol乙酸）、乙酸分6次、間隔時間3h、分子篩2g、搖床轉(zhuǎn)速140r/min、反應(yīng)溫度45℃、時間36h。此條件下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證產(chǎn)物乙酸異戊酯、乙酸異丁酯和乙酸丙酯的產(chǎn)率分別為90.1%、91.3%和78.1%。

表2 雜醇油轉(zhuǎn)化酯類香料工藝條件的正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 2 The results and analysis of orthogonal experiment design

表2的K值和R值也表明，優(yōu)化后的乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸丙酯達(dá)到最高產(chǎn)率的試驗(yàn)因素、水平等條件并不完全一致，這可能與雜醇油中異戊醇、異丁醇、丙醇的極性差異，導(dǎo)致非水相條件下底物與脂肪酶作用的最佳催化活性的差異有關(guān)?？紤]到雜醇油中含量最高的是異戊醇，因此選擇乙酸異戊酯產(chǎn)率為最高的條件作為優(yōu)化反應(yīng)條件。

3 結(jié)論

采用間歇式加酸、加入適量分子篩吸水劑可明顯提高混合酯得率；在正己烷10mL、雜醇油3mL、乙酸1.5mL的反應(yīng)體系中，以乙酸異戊酯產(chǎn)率最高為目標(biāo)，正交試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化后的工藝條件：脂肪酶Novozym 435FG用量70mg、乙酸分6次加入、乙酸加入間隔時間3h、分子篩用量2g、搖床轉(zhuǎn)速140r/min、反應(yīng)溫度45℃、反應(yīng)時間36h。在以上條件下，其乙酸異戊酯、乙酸異丁酯和乙酸丙酯的產(chǎn)率分別為90.1%、91.3%和78.1%。

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Preparation of natural ester aromas with lipase－catalyzed synthesis in non－aqueous media

WANG Cheng－tao DING Xiao－ying ZHANG Jia－chan ZHAO LeiSUN Bao－guo

（1.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing100048，China；2.Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University（BTBU），Beijing100048，China）

In order to improve the utilization ratio and added value of fusel oil，enzymic synthesis was studied of fusel oil into natural ester aromas using immobilized lipase Novozym 435FG.The results showed that ester yield rates were affected on the dosage of Novozym 435FG and molecular sieve，added times and time interval of acetic acid，shaker speed，reaction temperature and reaction time.And the ester yield rates were obviously increased using defined amount of molecular sieve and batch－added of acetic acid.In the reaction system of hexane 10mL，fusel oil 3mL，and acetic acid 1.5mL，the optimized conditions by orthogonal experiment design were that Novozym 435FG was 70mg，acetic acid was added six times and interval time 3h， molecular sieve was 2.0g，shaker speed was 140r/min，reaction temperature was 45 ℃，and reaction time was 36h.Under the optimization conditions，the yield rates of isopentyl acetate，isobutyl acetate，propyl acetate were 90.1%，91.3%and 78.1%，respectively.

fusel oil；lipase；non－aqueous media；lipase－catalyzed synthesis；natural ester aromas.

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.004

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：31071593）；北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教計劃項(xiàng)目（編號：PHR201008237）；北京工商大學(xué)研究生科研學(xué)術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（編號：19000101026）

王成濤（1969－），男，北京工商大學(xué)教授，博士。E－mail：wct5566＠163.com

2011－08－01