李晨，陳宏文

（華僑大學 工業(yè)生物技術福建省高校重點實驗室，福建 泉州 362021）

米曲霉木聚糖酶高產菌株選育

李晨，陳宏文

（華僑大學 工業(yè)生物技術福建省高校重點實驗室，福建 泉州 362021）

以米曲霉C－2為出發(fā)菌株，紫外誘變后，利用透明圈初篩，再分別以農業(yè)廢棄物1%蔗渣－1%麩皮復合物、2%蔗渣、2%堿提蔗渣半纖維素和2%纖維素溶劑分餾法（CSLF）提取的蔗渣半纖維素為碳源搖瓶復篩，得到一株高產木聚糖酶的米曲霉菌株A73.結果表明：米曲霉A73在上述碳源培養(yǎng)基中，產木聚糖酶酶活力比出發(fā)菌株分別提高了281.15%，82.81%，56.09%和33.11%；CSLF蔗渣半纖維素誘導米曲霉C－2及其誘變菌株產酶能力較弱，明顯低于其他3種誘導物.

木聚糖酶；米曲霉；紫外誘變；纖維素溶劑木質纖維素分餾法；半纖維素

半纖維素是以木聚糖為主要成分的雜多糖，在自然界碳水化合物中含量僅次于纖維素.木聚糖酶是將木聚糖（半纖維素）降解成低聚木糖或木糖的木糖苷鍵水解酶酶系［1］.目前的工業(yè)生產中，木聚糖酶生產菌主要涉及桿菌、放線菌及真菌中的酵母和霉菌，其中絲狀真菌如曲霉類黑曲霉、瑞氏木霉等因產酶水平高于酵母菌和細菌而引起關注［2］.米曲霉（Aspergillus oryzae）具有許多獨特的生物特征，能胞外分泌大量的木聚糖降解酶，如β－1，4－D－內切木聚糖酶、β－1，4－D－木糖苷酶和α－L－阿拉伯呋喃糖苷酶等［3-5］.人們期望能利用其木聚糖酶的水解物木糖生產燃料乙醇、食品和醫(yī)藥保健品低聚木糖、多元糖醇等，或者直接生產食品級酶制劑.因此，提高木聚糖酶酶活力是米曲霉有效利用半纖維素（木聚糖）用于自身生長和發(fā)酵的關鍵，但關于米曲霉木聚糖酶的相關報道較少.纖維素溶劑木質纖維素分餾法（cellulose solvent－based lignocellulose fractionation，簡稱CSLF）［6］是近幾年來提出的，利用纖維素溶脹試劑濃磷酸、有機溶劑丙酮和水來分離纖維素、半纖維素和木質素的新方法.該方法處理條件溫和（常壓，50℃）、時間短（2～4h）、試劑易回收，所得到的纖維素去結晶明顯，酶觸及性高；而且，糠醛、羥甲基糠醛、酚類衍生物和乙酸等抑制副產物少，通過高效液相色譜檢測的木聚糖（半纖維素）提取率可達45%～65%［7-9］.但是，目前還沒有關于CSLF半纖維素成品利用的報道.本文以米曲霉C－2為出發(fā)菌株，通過紫外線誘變，分別利用農業(yè)廢棄物蔗渣－麩皮復合物、蔗渣、堿提蔗渣半纖維素和CSLF半纖維素篩選木聚糖酶高產菌株，并考查了CSLF半纖維素誘導米曲霉C－2及其誘變菌株產木聚糖酶的效果.

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

（1）材料 .米曲霉菌株C－2，實驗室保存菌種.蔗渣榨汁后用水清洗，盡量去除蔗渣中殘留的蔗糖，置于60℃烘箱4d烘干.將干燥的蔗渣用中藥粉碎機粉碎，篩取40～60目蔗渣粉備用（保存于燥劑器中）.丙酮（AR級，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸（AR級，廣東汕頭西隴化工廠）；無水乙醇（AR級，福建廈門德邦化工有限公司）.

（2）儀器.4K15型大容量高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；D2F－6020型真空干燥箱（上海博源實業(yè)有限公司）；DKZ－2型電熱恒溫震蕩水槽（上海精密實驗設備有限公司）；UV－2800AH型紫外可見分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）.

1.2 培養(yǎng)基

（1）基礎培養(yǎng)基（質量分數(shù)）：2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%KH2PO4，0.1%NaNO3，0.007%Uracil，0.015%Uridine，0.1%MgSO4·7H2O，1.5%瓊脂，pH＝6.0.

（2）初篩雙層培養(yǎng)基：下層為1.5%水瓊脂層，上層為堿提半纖維素培養(yǎng)基，即將基礎培養(yǎng)基的葡萄糖用堿提半纖維素替代.

（3）種子培養(yǎng)基（液體基礎培養(yǎng)基）：復篩培養(yǎng)基碳源分別為1%蔗渣粉－1%麩皮，2%蔗渣粉，2%堿提蔗渣半纖維素，2%CSLF蔗渣半纖維素，其他與基礎培養(yǎng)基相同.

1.3 實驗方法

1.3.1 蔗渣半纖維素的提取 蔗渣半纖維素提取采用如下兩種方法：（1）堿提法 .詳見參考文獻［10］；（2）CSLF法 .稱取1g的蔗渣粉，加入8mL質量分數(shù)為85%的濃磷酸，攪勻，于50℃，150r·min－1下水浴振蕩40min；加入冰冷的丙酮充分攪拌停止反應，使溶于磷酸的纖維素和半纖維素析出，以及不溶于磷酸的木質素溶于40mL的預冷丙酮中 .在7 000r·min－1下離心10min，棄去含有木質素的上清丙酮溶液，再用40mL丙酮洗滌沉淀3次，以去除殘余木質素和磷酸，得到總纖維素（纖維素和半纖維素）沉淀；同上述方法再用40mL蒸餾水洗滌總纖維素沉淀3次，以分離溶于水的半纖維素和不溶于水的纖維素.最后，通過調節(jié)pH值抽濾、減壓蒸餾，以及利用半纖維素不溶于乙醇的特點，在7 000r·min－1下離心10min，用3～4倍體積的無水乙醇將水提液中的半纖維素醇沉分離出來.

1.3.2 菌種誘變 斜面接種，于30℃靜置培養(yǎng)3d，加入10mL無菌水，用接種環(huán)將所有孢子刮下，經4層擦鏡紙過濾得孢子懸液.將孢子懸液鏡檢并適當稀釋到103～104個·L－1備用.

紫外線燈（30W）預熱20min，取2mL上述孢子懸液于直徑為90mm的培養(yǎng)皿（用黑色膠帶全部粘住以避光）中，放置在紫外燈30cm（垂直距離）處照射 .照射時勻速晃動平板使得照射均勻.將照射過的菌液于暗室放置2h后，稀釋103倍和104倍，分別涂布到基礎培養(yǎng)基平板，涂布量為每個器皿0.2 mL，于30℃避光靜置培養(yǎng)2d，然后，計數(shù)菌落，計算致死率（η）并繪制致死率曲線.

1.3.3 菌株的篩選 （1）初篩.挑取誘變平板上所有的菌落到半纖維素雙層培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)3d，然后挑選平板上生長快且HC值（HC＝透明圈直徑D透明圈／菌落直徑D菌落）大的菌落，傳2代后點接到初篩培養(yǎng)基上進一步篩選，篩取HC值大的菌落，縮小復篩量.（2）復篩.將初篩選出的菌株轉接到基礎斜面培養(yǎng)基繼續(xù)傳種3代.在45mL種子培養(yǎng)基中接種2環(huán)菌體，于30℃，200r·min－1下培養(yǎng)24h后，抽濾培養(yǎng)基得到菌球并接種到250mL搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量50mL.接種后用8層紗布扎口，置于30℃，200r·min－1培養(yǎng)箱培養(yǎng)96h，測木聚糖酶酶活力.

1.3.4 木聚糖酶酶活的測定 取搖瓶培養(yǎng)液于4℃，12 000r·min－1離心10min，得上清粗酶液.用樺木木聚糖（birch wood xylan）做為底物.稱取1.0g樺木木聚糖，盡可能溶解于80mL 0.05mol·L－1的Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液（pH＝6.8）中，121℃滅菌15min，取出后搖勻木聚糖溶液使其充分溶解；冷卻至室溫后，再用上述緩沖液定容至100mL，配制成質量分數(shù)為1%的木聚糖溶液，置于－20℃保存?zhèn)溆?取0.9mL上述木聚糖溶液到試管中，于50℃預熱1min，加入適當稀釋的粗酶液0.1mL，50℃反應3min，利用DNS法［11］測定產生的還原糖.木聚糖酶酶活力（z）的計算式為

其中：M為酶液稀釋倍數(shù)；A為酶解溶液中木糖的含量；V為酶液量；t為酶解時間.酶活單位的定義：在50℃，pH＝6.8的最適合條件下，每秒鐘使得每摩爾底物樺木木聚糖轉化所需的酶量.

2 結果與討論

2.1 半纖維素的分離和回收

利用CSLF法提取得到的半纖維素水提液用CaCO3調節(jié)pH值，一邊加入CaCO3一邊不停攪拌，當pH值達到4～5時停止加入；靜置10min后抽濾得到清液，再利用旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸餾得到濃縮液，用3～4倍無水乙醇進行醇沉，靜置得到白色半纖維素沉淀；然后，于7 000r·min－1離心10min得到半纖維素，用95%乙醇離心洗滌2次，再真空干燥至恒重.

醇沉前，溶液pH值對半纖維素醇沉形態(tài)和得率有重要影響.隨著pH值的升高，半纖維素得率先升后降，但在pH值為4～5之間得率最高且變化不大.醇沉前溶液的pH值小于3或大于7時，半纖維素為顆粒狀，形成沉淀難，醇沉速度慢；而pH值在3～5時，醇沉的半纖維素為絮狀，醇沉速度快.干燥之后得到的半纖維素為白色或淺棕色粉末狀，難溶于pH值大于4的水溶液，降低pH值可以使其慢慢溶解為棕色溶液，再提高pH值又可使其再沉析出來 .因此，CSLF半纖維素為酸溶性物質.

2.2 致死率曲線

紫外燈功率30W，照射距離30cm，分別照射0，45，90，135，180，225s后稀釋涂布平板，30℃培養(yǎng)2d計數(shù).結果表明，稀釋104倍時菌落生長數(shù)目和分散度較適宜 .計算其致死率（η），繪制致死率曲線，如圖1所示.實驗選擇致死率在75%的紫外線劑量［12］，照射時間為173s.

2.3 透明圈法初篩

采用紫外線照射劑量173s作為誘變劑量，稀釋104倍后涂布于基礎培養(yǎng)基.30℃培養(yǎng)2d后共挑取73株菌落點接到雙層培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d出現(xiàn)明顯透明圈.將培養(yǎng)皿置于冰箱中過夜，使得透明圈更清晰，測量透明圈和菌落直徑，計算菌落HC值.挑選HC值較大的23株，傳2代后點接到初篩雙層培養(yǎng)基上進行第2次透明圈篩選 .根據(jù)HC值大小選取6株菌株進行復篩，分別編號為A26，A33，A48，A54，A69和A73，其HC值和透明圈分別如表1，圖2所示.

圖1 出發(fā)菌株C－2的致死曲線Fig.1 Lethal curve of initial strain C－2

表1 菌株的HC值Tab.1 HC values of strains

圖2 透明圈法篩選木聚糖酶高產菌Fig.2 Transparent circle screening for high－yield xylanase strains

2.4 菌種復篩

蔗渣－麩皮、蔗渣、堿提蔗渣半纖維素和CSLF蔗渣半纖維素碳源誘導各菌株的產酶情況，結果如表2所示.

表2 碳源對各菌株產酶的影響Tab.2 Effect of carbon sources on xylanase production by strains

2.4.1 蔗渣－麩皮復合碳源 從表2可知：以蔗渣－麩皮為碳源，菌株A69產酶能力較出發(fā)菌株C－2提高42.94%，低于其他菌株，菌株A26和A33產酶能力相近，菌株A73的木聚糖酶酶活力最高，較出發(fā)菌株C－2提高2.81倍.

2.4.2 蔗渣碳源 從表2可知：以2%蔗渣為碳源，菌株A48的產酶能力較弱，比出發(fā)菌株C－2僅提高4.50%；菌株A73產酶能力最強，是出發(fā)菌株C－2的1.83倍.與麩皮－蔗渣復合碳源相比，包括出發(fā)菌株C－2在內的7個菌株生產的木聚糖酶酶活力都有所上升，但產酶能力提高幅度低于復合碳源培養(yǎng)基.

2.4.3 堿提蔗渣半纖維素碳源 從表2可知：菌株A73的木聚糖酶酶活力最高，在出發(fā)菌株C－2基礎上提高了56.09%，而菌株A48卻最低，僅僅提高了23.21%.

2.4.4 CSLF蔗渣半纖維素碳源 從表2可知：CSLF蔗渣半纖維素誘導各菌株產木聚糖酶的能力明顯低于其他誘導底物.與出發(fā)菌株C－2相比，菌株A48在以蔗渣和堿提蔗渣半纖維素為碳源的培養(yǎng)基中產酶能力幾乎沒有提高，但是在CSLF蔗渣半纖維素誘導下比出發(fā)菌株C－2提高了51.97%.

3 討論

雖然組成型生產木聚糖酶［13］亦有報道，但是木聚糖酶主要是誘導酶，受到培養(yǎng)基中木聚糖和富含木聚糖物質的誘導合成和分泌.農業(yè)廢棄物小麥麩皮、玉米芯、甘蔗渣和水稻秸稈等都可以用于木聚糖酶的誘導生產.實驗結果表明：在以蔗渣－麩皮、蔗渣和堿提蔗渣半纖維素為誘導物的培養(yǎng)基中，菌株A73產木聚糖酶酶活力在7種菌株中都是最高，相對出發(fā)菌株C－2都有大幅度的提高，蔗渣－麩皮誘導甚至高出2.81倍.7個菌株中，大多菌株在不同誘導物中的產酶能力都有較大變化，但菌株A73在幾種誘導物間產酶能力最穩(wěn)定.

對4種碳源的誘導能力（表2）進行比較可以發(fā)現(xiàn)：除菌株A73外，其他所有菌株在以蔗渣為誘導物時產木聚糖酶酶活力幾乎是蔗渣－麩皮的兩倍，略低于堿提半纖維素；而以CSLF半纖維素為碳源時，酶活力顯著降低.總體來說，堿提半纖維素誘導該7株米曲霉產木聚糖酶能力最強，蔗渣其次，CSLF半纖維素最弱.

CSLF蔗渣半纖維素誘導各菌株產木聚糖酶酶活力非常低.一般來說，半纖維素抽提過程中常有乙酸、糠醛，羥甲基糠醛和酚類衍生物等抑制性副產物生成，對菌株代謝具有抑制作用.但是，CSLF法提取條件溫和，較少產生抑制性副產物糠醛等［6］，并且半纖維素水提液經減壓蒸餾后，抑制副產物基本去除.因此，CSLF蔗渣半纖維素誘導米曲霉C－2及其誘變菌株生產的木聚糖酶酶活力較低與抑制性副產物無關.

米曲霉代謝木聚糖過程中，木聚糖大分子無法進入細胞中，而誘導木聚糖酶的物質主要是由少量組成型木聚糖酶水解木聚糖形成的低分子量的木聚糖片段 .因此，木聚糖酶的表達水平受到酶作用底物木聚糖的性質（如易感性）、濃度、釋放低聚木糖的速率和釋放量影響.另外，CSLF法得到的半纖維素為乳白色，與天然木質素顏色相近［14］.該方法得到的半纖維素中可能含有木質素成分.因為在木質纖維素中，纖維素與半纖維素和木質素通過氫鍵相連，而半纖維素和木質素之間除了氫鍵，還通過化學鍵連接緊密形成穩(wěn)定的木質素－碳水化合物結構（LCC）［15］.

CSLF法處理木質纖維素過程中，木質素和半纖維素之間的化學鍵可能沒有全部斷裂，而是形成大量水溶性片段LCC.由于LCC片段為兩親性［16］，不能溶解在弱極性的有機溶劑中［17］.因此，在對提取濃縮液進行醇沉時，LCC片段隨分離出的半纖維素一起沉淀下來.CSLF法提取的蔗渣半纖維素為乳白色粉末狀，酸溶性，其成分、含量和結構性質，以及其對產木聚糖酶的影響都有待進一步研究.

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Breed of Aspergillus oryzae Producing High－Yield Xylanase

LI Chen，CHEN Hong－wen
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Fujian Province University，Huaqiao University，Quanzhou 362021，China）

Aspergillus oryzae C－2was treated with ultraviolet irradiation.High－yield xylanase mutant A73was obtained after primary transparent circle screening and secondary screening in which 4different carbon sources－1%wheat bran－1%sugarcane bagasse，2%sugarcane bagasse，2%alkali pretreatment hemi－cellulose and 2%CSLF（cellulose solvent－based lignocellulose fractionation）pretreatment hemi－cellulose were used as fermentation substrates.The xylanase activity of Aspergillus oryzae A73improved 281.15%，82.81%，56.09%and 33.11%compared with the original strain on respective carbon source，but the xylanase activity induced by CSLF pretreatment hemi－cellulose was apparently lower than that of other substrates.

xylanase；Aspergillus oryzae；ultraviolet irradiation；cellulose solvent－based lignocellulose fractionation；hemi－cellulose

錢筠 英文審校：劉源崗）

Q 933；TQ 914.3

A

1000－5013（2011）06－0663－05

2011－03－23

陳宏文（1969－），女，副教授，主要從事生物工程和基因工程的研究.E－mail：chenhw＠hqu.edu.cn.

福建省自然科學基金資助項目（D0810015）；教育部留學回國人員科研啟動項目（2010）；福建省高等學校新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目（07FJRC03）