葉明樹(shù)，田治富，胡慶，莊其仁

（華僑大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，福建 泉州 362021）

脈沖LED激發(fā)羅丹明B瞬態(tài)熒光光譜特征

葉明樹(shù)，田治富，胡慶，莊其仁

（華僑大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，福建 泉州 362021）

采用發(fā)光二極管（LED）脈沖光源作為激發(fā)光，研究羅丹明B熒光的瞬態(tài)光譜特征.激發(fā)光源為3個(gè)中心發(fā)射波長(zhǎng)分別為406，464和528nm的超高亮紫光、藍(lán)光和綠光LED.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同激發(fā)光顏色（波長(zhǎng)）、不同脈沖寬度和不同羅丹明B濃度得到的熒光強(qiáng)度有很大差別；在同一濃度下，激發(fā)光持續(xù)時(shí)間（脈沖寬度）小于10ms，只有綠光激發(fā)能產(chǎn)生強(qiáng)的熒光，紫光和藍(lán)光不能產(chǎn)生熒光；而脈沖寬度大于20ms時(shí)，紫光和藍(lán)光激發(fā)有熒光出現(xiàn)，但強(qiáng)度都比綠光激發(fā)時(shí)小很多，并且藍(lán)光激發(fā)時(shí)熒光最弱.采用合適脈沖寬度的紫光、藍(lán)光和綠光LED作為激發(fā)光源，可以得到羅丹明B的特征熒光光譜 .

發(fā)光二極管；羅丹明B；熒光光譜；脈沖寬度

傳統(tǒng)的熒光儀器大多采用脈沖氙燈、激光器、汞燈等作為激發(fā)光源，不僅需要高壓供電，而且體積大、成本高，無(wú)法滿足實(shí)時(shí)原位監(jiān)測(cè)的要求.近年來(lái)，隨著發(fā)光二極管（LED）技術(shù)和工藝的不斷提高，各種超高亮、短波長(zhǎng)的LED不斷出現(xiàn)，使得LED的發(fā)射波長(zhǎng)幾乎覆蓋了整個(gè)近紫外－近紅外光譜區(qū)，有望取代傳統(tǒng)激發(fā)光源［1-2］.然而，熒光光譜儀由于受到激發(fā)光源、單色儀和探測(cè)器的光譜特性的影響，其熒光光譜（激發(fā)光譜和發(fā)射光譜）并不是所研究物質(zhì)的真實(shí)光譜，而要得到物質(zhì)的真實(shí)光譜，一般要采用羅丹明B法［3-5］對(duì)實(shí)驗(yàn)光譜進(jìn)行校正.羅丹明B熒光染料具有光穩(wěn)定性好，對(duì)pH值不敏感，較寬的波長(zhǎng)范圍和較高的熒光量子產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)，是分析化學(xué)和生物醫(yī)藥科學(xué)等生物技術(shù)領(lǐng)域中最常用的熒光染料.已有的文獻(xiàn)中，采用常規(guī)光源和分光光度計(jì)法測(cè)量羅丹明B二維及三維熒光光譜的報(bào)道較多［6-9］.司馬偉昌等［10］報(bào)道了采用多波長(zhǎng)LED陣列誘導(dǎo)羅丹明B的熒光發(fā)射光譜.本文采用電子快門控制光脈沖，研究LED激發(fā)羅丹明B熒光的瞬態(tài)光譜特征.

1 實(shí)驗(yàn)方法

圖1為實(shí)驗(yàn)裝置原理圖，由LED激發(fā)光源、樣品池、聚焦透鏡和光纖光譜儀共同組成.激發(fā)光源為中心發(fā)射波長(zhǎng)分別為406，464和528nm的3個(gè)超高亮紫、藍(lán)、綠發(fā)光二極管（LED），直徑均為5mm，LED為半球形封裝，具有較小的光束發(fā)散角（小于15°），樣品池大小為12mm×12mm×450mm.

激發(fā)光從一個(gè)方向入射樣品池，在垂直方向上由焦距50mm的聚焦透鏡收集熒光，在焦點(diǎn)處為USB 4000型光纖光譜儀（美國(guó)Ocean Optics公司）的光纖入射端面，最后由計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.LED光源采用恒流驅(qū)動(dòng)輸出，幅度穩(wěn)定，激發(fā)光脈沖通過(guò)1／1 000s的電子快門控制，激發(fā)光脈沖寬度控制為50ms.

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置原理圖Fig.1 Experimental schematic diagram

實(shí)驗(yàn)所用工作液采用母液逐級(jí)稀釋得到 .首先取0.50g羅丹明B用少量水溶解，于500mL容量瓶中定容，然后取1mL羅丹明B溶液在量筒中稀釋，再進(jìn)行熒光測(cè)定.光纖光譜儀的積分時(shí)間是5ms，光譜儀的工作方式設(shè)定為外部觸發(fā)，觸發(fā)信號(hào)由控制電子快門的單片機(jī)發(fā)出.由于電子快門開(kāi)啟跟關(guān)閉相對(duì)于光譜儀都有延遲，所以電子快門跟光譜儀的開(kāi)啟時(shí)間誤差會(huì)前后相減延遲而抵消，達(dá)到整個(gè)系統(tǒng)的時(shí)間同步.Atmega16單片機(jī)（美國(guó)Atmel公司）系統(tǒng)時(shí)鐘設(shè)定為8MHz，以減少定時(shí)時(shí)間誤差.

2 結(jié)果和分析

2.1 LED光源的發(fā)射譜

紫光、藍(lán)光和綠光LED的發(fā)射光譜，如圖2所示.3種LED光源的中心發(fā)射波長(zhǎng)分別為406，464和528nm，峰值相對(duì)光強(qiáng)度相差不大（約62 000單位），光譜半高全寬分別為25，33和45nm.并且，528 nm綠光LED的發(fā)射光譜基本覆蓋了羅丹明B最大量子產(chǎn)率的554～566nm激發(fā)波長(zhǎng)范圍［6］.

2.2 瞬態(tài)熒光光譜特征

分別用上述紫光、藍(lán)光和綠光LED光脈沖激發(fā)羅丹明B溶液（質(zhì)量濃度為0.5g·L－1），其瞬態(tài)熒光光譜分別如圖3～5所示.

從圖3（a）可看出：紫光脈沖激發(fā)羅丹明B溶液時(shí)，熒光峰值波長(zhǎng)在625nm左右，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，25 ms熒光峰值達(dá)到穩(wěn)定的最大值，其相對(duì)光強(qiáng)度約3 000個(gè)單位，25ms后，長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度繼續(xù)增大，40ms后熒光光譜基本穩(wěn)定不變.從圖3（b）可看出，當(dāng)紫光脈沖熄滅后，熒光強(qiáng)度急劇下降，5ms后熒光強(qiáng)度就下降到最大值的一半以下，并且峰值波長(zhǎng)和短波長(zhǎng)部分下降速度最快，長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度下降速度較慢.

從圖4（a）可知：藍(lán)光激發(fā)羅丹明B熒光有很大的延遲，在激發(fā)光入射20ms后才有明顯的熒光出現(xiàn)，并且強(qiáng)度很低.20ms的熒光光強(qiáng)緩慢增長(zhǎng)，45ms的熒光強(qiáng)度才達(dá)到最大，但幅度很小，峰值約1 750個(gè)單位.從圖4（b）可以看出，藍(lán)光激發(fā)的羅丹明B熒光的消失也比較緩慢.

從圖5（a）可以看出：與紫光和藍(lán)光激發(fā)羅丹明B熒光比較，綠光激發(fā)的熒光出現(xiàn)速度最快，10ms就有很明顯的熒光出現(xiàn)，其峰值約3 000個(gè)單位；10ms的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，其峰值約9 600個(gè)單位，10ms后的熒光光譜向長(zhǎng)波長(zhǎng)展寬.從圖5（b）可以看出，綠光激發(fā)的熒光在激發(fā)光熄滅后強(qiáng)度快速下降，10ms后已下降至最大值的5%以下.

圖2 3種LED光源的發(fā)射光譜Fig.2 Emission spectrum of three LED sources

圖3 紫光LED瞬態(tài)熒光光譜Fig3 Transient fluorescence spectra excited by the purple LED light pulse

圖4 藍(lán)光LED瞬態(tài)熒光光譜Fig.4 Transient fluorescence spectra excited by the blue LED light pulse

圖5 綠光LED瞬態(tài)熒光光譜Fig.5 Transient fluorescence spectra excited by the green LED light pulse

2.3 羅丹明B熒光與激發(fā)光脈沖寬度的關(guān)系

不同質(zhì)量濃度的羅丹明B被紫色、藍(lán)色和綠色LED激發(fā)出熒光的時(shí)間和熒光的熄滅時(shí)間并沒(méi)有明顯的不同，但是在熒光峰值和峰值中心卻有著很大的差異.紫色、藍(lán)色和綠色LED激發(fā)不同質(zhì)量濃度（ρ）的羅丹明B的熒光光譜，如圖6所示.

從圖6可知：不同質(zhì)量濃度的羅丹明B被紫色、藍(lán)色和綠色LED激發(fā)出的熒光光譜同樣在25，45和10ms時(shí)峰值達(dá)到最大.在羅丹明B濃度增加的情況下，光譜的峰值逐漸降低，而且熒光中心都明顯的紅移了.發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移可能是由于溶液質(zhì)量濃度過(guò)大，羅丹明B發(fā)生聚集狀態(tài)形成了二聚體或多聚體后，導(dǎo)致能量在組分分子間來(lái)回轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)了分子在發(fā)生熒光之前的壽命［11］.同時(shí)，由于可能存在的自熄滅作用增強(qiáng)，所以體系的熒光強(qiáng)度隨著羅丹明B質(zhì)量濃度的增加反而減小.

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，羅丹明B的熒光光譜不但與激發(fā)光波長(zhǎng)有關(guān)，還與激發(fā)光持續(xù)時(shí)間有關(guān).從圖6還可以看出，不同激發(fā)光顏色（波長(zhǎng)）和脈沖寬度得到的羅丹明B熒光強(qiáng)度有很大差別 .當(dāng)激發(fā)光持續(xù)時(shí)間（脈沖寬度）小于10ms時(shí)，只有綠光激發(fā)能產(chǎn)生強(qiáng)的熒光，紫光和藍(lán)光不能產(chǎn)生熒光；當(dāng)脈沖寬度大于20ms時(shí)，紫光和藍(lán)光激發(fā)有熒光出現(xiàn)，但強(qiáng)度都比綠光激發(fā)時(shí)小很多，并且藍(lán)光激發(fā)時(shí)熒光最弱.

圖6 不同質(zhì)量濃度的羅丹明B熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of rhodamine B in different concentrations

從圖5（a）還可以看出，激發(fā)光持續(xù)時(shí)間（脈沖寬度）小于10ms時(shí)，綠光激發(fā)產(chǎn)生的熒光光譜寬度窄，激發(fā)光持續(xù)時(shí)間增加，熒光光譜寬度變寬 .因此，采用合適的激發(fā)光持續(xù)時(shí)間（脈沖寬度）的紫光、藍(lán)光和綠光LED作為激發(fā)光源，可以得到羅丹明B的特征熒光光譜，如圖7，8所示.圖7，8中：激發(fā)光脈沖寬度為10ms.

圖7 熒光峰值強(qiáng)度跟激發(fā)光持續(xù)時(shí)間的關(guān)系Fig.7 Relationship between fluorescence peak intensity and excited light duration

圖8 羅丹明B的光譜特征 Fig.8 Characteristics of fluorescence spectra of rhodamine B

3 討論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羅丹明B熒光光譜中包含熒光和磷光［12-13］現(xiàn)象 .當(dāng)激發(fā)光持續(xù)時(shí)間（脈沖寬度）小于10ms時(shí)，發(fā)光光譜主要為熒光光譜 .這是因?yàn)闊晒鈮勖?，有激發(fā)源時(shí)會(huì)發(fā)光，激發(fā)源去除后，熒光就立即消失.當(dāng)激發(fā)光脈沖寬度大于20ms時(shí)，紫光和藍(lán)光激發(fā)有熒光出現(xiàn)，綠光激發(fā)的熒光光譜展寬，主要向長(zhǎng)波長(zhǎng)展寬.這部分熒光包含了磷光成分，激發(fā)源去除后熒光依然存在（緩慢減弱）.因此，羅丹明B特征熒光光譜才是沒(méi)有磷光成分的純熒光光譜，該特征光譜可用于羅丹明B成分檢測(cè)和其他采用羅丹明B作為試劑的傳感領(lǐng)域.

瞬態(tài)熒光光譜測(cè)量方法，如采用波長(zhǎng)連續(xù)可調(diào)的激發(fā)光源，就能得到羅丹明B的四維熒光光譜（激發(fā)－發(fā)射－時(shí)間－熒光光譜）.相比較于三維熒光光譜圖，羅丹明B的四維熒光光譜圖更能詳細(xì)描述被測(cè)組分的性質(zhì).

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Spectrum Characteristics of the Transient Fluorescence Spectra of Rhodamine B Stimulated by Pulsed LED

YE Ming－shu，TIAN Zhi－fu，HU Qing，ZHUANG Qi－ren
（College of Information Science and Engineering，Huaqiao University，Quanzhou 362021，China）

In this paper，light－emitting diode（LED）source as excitation light pulses is used to study the transient spectra characteristics of rhodamine B.Excitation light source with three central wavelengths are 406nm，464nm and 528nm super bright purple，blue and green LED.Experimental results show that the fluorescence intensities are very different with the different excitation light color（wavelength），pulse duration and different concentration of the rhodamine B.In the same concentration，if the excitation duration（pulse width）is less than 10ms，only green fluorescent excitation can produce strong fluorescence，purple and blue light can not produce fluorescence；if the pulse width is greater than 20ms，the purple and blue can excite fluorescence but the intensity of excitation is much smaller than that of the green，and the fluorescence of blue is weakest.Using a suitable pulse width of purple，blue and green LED as the excitation source，the characteristics of the fluorescence spectra of rhodamine B can be obtained.

light emitting diode；rhodamine B；fluorescence spectra；pulse duration

黃曉楠 英文審校：吳逢鐵）

TN 29

A

1000－5013（2011）06－0623－05

2010－11－22

莊其仁（1960－），男，教授，主要從事光檢測(cè)技術(shù)的研究.E－mail：qrzhuang＠hqu.edu.cn.

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（A0710012）