高立宏，張春玉，柴 娜，路云俠，劉 寶，劉立俠

（1.長春師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130032；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130024；3.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130033）

水稻轉(zhuǎn)座子Pong特異性RNAi載體TPAS的構(gòu)建和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

高立宏1，2，張春玉3，柴 娜2，路云俠2，劉 寶2，劉立俠2

（1.長春師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130032；2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130024；3.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130033）

為研究水稻轉(zhuǎn)座子Pong的功能，構(gòu)建了Pong的特異RNAi表達(dá)載體TPAS，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將這個載體轉(zhuǎn)化到水稻的成熟胚愈傷組織，獲得了PCR陽性的再生植株.同時通過對農(nóng)桿菌侵染途徑、侵染濃度和侵染時間等的研究，建立并優(yōu)化了水稻的遺傳轉(zhuǎn)化程序.結(jié)果表明：在農(nóng)桿菌侵染成熟胚愈傷組織的時間為3 min，共培養(yǎng)2～4 d，預(yù)培養(yǎng)7 d，G418質(zhì)量濃度為150～200 mg／L條件下篩選7 d，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到30%，為最佳的遺傳轉(zhuǎn)化參數(shù).研究結(jié)果為今后水稻轉(zhuǎn)座子Pong功能的進(jìn)一步研究提供了一定的基礎(chǔ)和參考.

水稻；轉(zhuǎn)座子；RNAi；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；遺傳轉(zhuǎn)化

水稻（OryzasativaL.）是禾本科植物中基因組最小的作物，被公認(rèn)為是禾谷類作物遺傳研究的模式植物［1－2］.在植物體中，表觀遺傳的調(diào)控影響著遺傳轉(zhuǎn)化中很多的基因表達(dá)過程，包括轉(zhuǎn)座子活性的改變［3］、同源依賴的轉(zhuǎn)基因沉默［4－5］等.轉(zhuǎn)座子（transposable elements or transposons，Tn）是基因組中一段能夠移動的DNA序列，通過切割、重新整合等可從一個位置移動到另一個位置.Tn Pong全長為5 166 bp，是水稻轉(zhuǎn)座子中的一個較為特殊的成員，在秈稻和粳稻的基因組中都存在.在水稻基因組中，Pong大約有70個拷貝，NCBI上Pong基因（序列號BK000586）有兩個開放閱讀框（open reading frame，ORF），其中已知ORF2編碼轉(zhuǎn)座酶，而ORF1的功能尚未知.Tn Pong與轉(zhuǎn)座子Ping（transposon ping，Tn Ping）有相似的末端序列，同時在兩個ORF也有較高的同源性.本實驗構(gòu)建了Pong的ORF1上游與Ping非同源區(qū)域的RNAi載體，并將其利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)入到水稻中以獲得轉(zhuǎn)化的陽性植株，為進(jìn)一步的研究提供了實驗材料，并通過對再生植株的表型觀察及分子檢測，證明外源基因已經(jīng)整合到水稻的基因組中.

1 實驗材料

1.1 植物材料

水稻品種為松前，由東北師范大學(xué)表觀遺傳學(xué)實驗室提供.

1.2 載體及菌株材料

大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404為本實驗室保存；中間載體p KANNIBAL，pPSP72，pBI121購自CLOETECH公司；PCR引物由上海生工公司合成.

1.3 水稻組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化使用的培養(yǎng)基

組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化使用的基本培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基，具體組成見表1.

表1 水稻組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化過程中使用的培養(yǎng)基組成

2 實驗方法

2.1 TPAS的RNAi載體的構(gòu)建

2.1.1 目的片段的克隆

根據(jù)NCBI上Pong基因（序列號BK000586）序列與Ping的非同源區(qū)域，設(shè)計以下引物：

利用PCR方法，以水稻松前的DNA為模板，以TPAS－P1與TPAS－P2為引物，擴(kuò)增了目的基因片段TPAS－；以TPAS－P1與TPAS－P3為引物，擴(kuò)增了目的基因片段TPAS＋，兩片段長度均為222 bp.

2.1.2 TPAS的RNAi載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物TPAS－與質(zhì)粒p KANNIBAL進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物命名為p KANNIBAL－；將TPAS＋用內(nèi)切酶Xba I，Kpn I雙酶切并連接到pSP72相應(yīng)的酶切位點上，產(chǎn)物命名為pSP72＋.然后用Xho I，Kpn I酶切pSP72＋，并連接到p KANNIBAL－相應(yīng)的酶切位置上（p KANNIBAL＋／－）；提?。╬ KANNIBAL＋／－）質(zhì)粒并酶切鑒定，鑒定結(jié)果表明已經(jīng)連入長度約1 300 bp的目的DNA片段.

將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒p KANNIBAL＋／－目的DNA正向、反向分別進(jìn)行測序.應(yīng)用BLAST軟件將克隆片段堿基序列與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)該序列與已登錄的數(shù)據(jù)完全相同.將構(gòu)建好的質(zhì)粒Xba I單酶切轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體PBI121中.HindIII酶切鑒定接入的目的序列的方向，獲得構(gòu)建好的載體TPAS.將獲得的轉(zhuǎn)化載體TPAS轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌4404中并進(jìn)行PCR鑒定.菌株保存在－80℃低溫冰箱中備用.

2.2 水稻組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

本實驗采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因材料［6－7］.結(jié)果表明組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化過程中的許多因素都能影響水稻的遺傳轉(zhuǎn)化效率，如供體材料的基因型，外植體的類型和生理狀態(tài)，培養(yǎng)基中的有機(jī)物、無機(jī)鹽和植物生長調(diào)節(jié)因子，培養(yǎng)條件如濕度、溫度以及光的強(qiáng)度等［8－9］.其中，基因型是組織培養(yǎng)中最大的限制因子.因為品種之間的脫分化和再分化能力存在差異，所以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化效率常常受到水稻品種遺傳背景的限制［10－12］.與其他水稻品種比較，本實驗室對松前的遺傳背景了解較透，且已經(jīng)建立了良好的組織培養(yǎng)體系，所以選擇松前作為實驗材料［13］.

水稻組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化的基本程序：將去殼的種子放入滅菌的三角瓶中，加75%的酒精消毒30 s，除去余液；加入0.1%升汞消毒10～20 min，消毒后的種子放入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶大約10粒；7～10 d后將長出的芽拔掉，只留下末端的愈傷組織，將其轉(zhuǎn)入到新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中.將生長21 d的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)后再培養(yǎng)7～10 d備用.菌液活化后利用NB液體培養(yǎng)基將其稀釋，然后將愈傷組織取出放到菌液中，侵染；用濾紙吸干愈傷組織表面的余液，再將愈傷組織轉(zhuǎn)入至共培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)基表面鋪上一層無菌濾紙，28℃暗培養(yǎng).2～7 d后將愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)一段時間，然后轉(zhuǎn)入到分化篩選培養(yǎng)基中；將篩選長出的小苗移到1／2 MS生根培養(yǎng)基中，待根生長健壯后，移入盆缽中繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)實.

2.2.1 農(nóng)桿菌菌液分?jǐn)?shù)的設(shè)計

調(diào)節(jié)TPAS菌液的分?jǐn)?shù)使其在600 nm的光吸收值D（600）為0.6，然后分別稀釋到其倍數(shù)的1×， 1／2×，1／3×，1／4×.將愈傷組織浸入上述已準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌溶液中侵染3～10 min，共培養(yǎng)至可以見到菌體.清洗掉愈傷上的菌體，再預(yù)培養(yǎng)7～10 d，然后轉(zhuǎn)入到分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，統(tǒng)計愈傷率.愈傷率（%）＝（產(chǎn)生新愈傷組織的塊數(shù)／接種的愈傷組織塊數(shù)）×100%.

2.2.2 農(nóng)桿菌浸染時間的設(shè)計

將TPAS菌液分?jǐn)?shù)稀釋到D（600）值為0.2，然后將愈傷組織放到農(nóng)桿菌溶液中分別侵染1，3，6，15，25 min，共培養(yǎng)3 d，預(yù)培養(yǎng)7 d，然后進(jìn)行分化培養(yǎng)，統(tǒng)計愈傷率、成苗率及轉(zhuǎn)化植株數(shù).

2.2.3 共培養(yǎng)時間的選擇

將TPAS菌液分?jǐn)?shù)稀釋到D（600）值為0.2，然后將愈傷組織放到農(nóng)桿菌溶液中侵染3 min，用無菌濾紙吸干余液后，轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)時間分別為1，2，3，4 d（在培養(yǎng)基表面鋪上一層無菌濾紙），再轉(zhuǎn)入到分化培養(yǎng)基中，統(tǒng)計愈傷率、成苗率及轉(zhuǎn)化植株數(shù).

2.2.4 預(yù)培養(yǎng)時間的選擇

將TPAS菌液分?jǐn)?shù)稀釋到D（600）值為0.2，然后將愈傷組織放到農(nóng)桿菌溶液中侵染3 min，用無菌濾紙吸干余液后，轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d；將共培養(yǎng)后的愈傷組織用乙酰丁香酮培養(yǎng)液或無菌水沖洗，至洗液為透明后，轉(zhuǎn)至預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)1，2，3，5，7 d后，轉(zhuǎn)入至分化培養(yǎng)基中，統(tǒng)計愈傷率、成苗率及轉(zhuǎn)化植株數(shù).

2.2.5 篩選濃度的選擇

用TPAS侵染愈傷組織3 min，共培養(yǎng)3 d，預(yù)培養(yǎng)7 d，然后進(jìn)行篩選培養(yǎng).篩選劑G418的質(zhì)量濃度分別為：0，20，40，50，100，200 mg／L，統(tǒng)計愈傷率、成苗率及轉(zhuǎn)化植株數(shù).

2.3 轉(zhuǎn)基因材料的種植和檢測

2.3.1 種植條件

轉(zhuǎn)基因植株生根培養(yǎng)后，將根長3～5 cm生長健壯的植株進(jìn)行煉苗，移栽到國際水稻營養(yǎng)液中，在26℃室內(nèi)弱光環(huán)境下成活后移至室外，自然條件下培養(yǎng)至結(jié)實.

2.3.2 GFP檢測

切取轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)后的長度為1～2 mm的幼苗嫩葉片，加一滴清水后用蓋玻片覆蓋，將蓋玻片按壓平整后在熒光顯微鏡下觀察.

2.3.3 PCR檢測

取葉片2 g，提取水稻基因組總DNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測是否含有NPTII基因.擴(kuò)增引物序列為：5′－AACAGACAATCGGCTGCTCT－3′，5′－CCACCATGATATTCGGCAAGCA－3′.

3 結(jié)果與分析

3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

本實驗利用CTAB法提取了水稻的基因組DNA［12］，電泳檢測表明，獲得的基因組DNA片段大小約為6 500 bp（見圖1A）；以總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物2μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得的DNA片段大小約為220 bp，電泳結(jié)果見圖1B；中間載體經(jīng)p KANNIBAL－TPAS－酶切檢測，獲得了220 bp的DNA片段，證明所連接的片段為目的DNA（見圖1C）.p KANNIBAL－TPAS＋／－XbaI單酶切得到大小約1 300 bp的片段（見圖1D），這和設(shè)計的RNAi的大小一致（兩個反向重復(fù)的目的基因之間的間隔片段大小為850 bp）.構(gòu)建的表達(dá)載體見圖2.

圖1 電泳檢測結(jié)果

3.2 水稻愈傷組織的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化優(yōu)化

3.2.1 農(nóng)桿菌菌液分?jǐn)?shù)對水稻愈傷組織侵染效果的影響

隨著農(nóng)桿菌分?jǐn)?shù)的增加，侵染后的愈傷組織活性逐漸下降，出愈率、成苗率也都隨之下降，但轉(zhuǎn)化率卻略有提升.表現(xiàn)為隨著農(nóng)桿菌分?jǐn)?shù)的增加共培養(yǎng)相同的時間，農(nóng)桿菌聚集在愈傷組織周圍的數(shù)量也逐步增加.1／3×稀釋菌液處理中，共培養(yǎng)3 d后，在愈傷組織和培養(yǎng)基接觸處略微可見農(nóng)桿菌的痕跡；而在1×液處理中的愈傷組織上很快長滿大量的農(nóng)桿菌，愈傷組織迅速呈現(xiàn)暗黃色，繼續(xù)放置2 d則變成暗褐色，愈傷組織逐漸死亡；在1／4×稀釋菌液處理中，需4～5 d方可看見愈傷組織與培養(yǎng)基接觸處略微有農(nóng)桿菌的痕跡，共培養(yǎng)后用無菌水洗去農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)入至分化培養(yǎng)基后，舊的愈傷組織上會生長出新的愈傷組織，出愈率隨著農(nóng)桿菌分?jǐn)?shù)的增加而降低，甚至全部褐化死亡，即使生長出部分愈傷，質(zhì)量也很差，分化能力很低（見表2）.

圖2 TPAS RNAi表達(dá)載體

3.2.2 農(nóng)桿菌浸染時間對侵染效果的影響

農(nóng)桿菌侵染時間在3～6 min時，差異不是很大，愈傷組織狀態(tài)較好.侵染1 min，愈傷組織狀態(tài)雖然很好，但共培養(yǎng)后在愈傷組織及培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)生長的農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化率很低；而侵染時間超過15 min后，隨著侵染時間的延長，愈傷組織的生長受到抑制，大量愈傷變成褐色，失去活性，同時出愈率和成苗率也隨著侵染時間的增加而下降.由表3可以得出結(jié)論：農(nóng)桿菌侵染3 min的效果較好.

表2 農(nóng)桿菌菌液分?jǐn)?shù)對水稻愈傷組織浸染效果的影響

表3 農(nóng)桿菌侵染時間對浸染效果的影響

3.2.3 共培養(yǎng)時間對農(nóng)桿菌侵染效果的影響

在菌液D（600）＝0.2，農(nóng)桿菌侵染愈傷組織3 min的條件下，共培養(yǎng)3 d后，獲得轉(zhuǎn)化苗4株，是獲得轉(zhuǎn)化苗數(shù)量最多的，因此3 d是最適合的共培養(yǎng)時間（見表4）.另外共培養(yǎng)時間、侵染時間和農(nóng)桿菌的分?jǐn)?shù)有關(guān)，菌液濃度越高，農(nóng)桿菌繁殖速度越快，越抑制愈傷組織的生長，使愈傷組織迅速褐化而失去活性；共培養(yǎng)的時間短雖然出苗率很高，但出現(xiàn)假陽性植株的比率就會增加，所以一般不能少于16 h.

表4 共培養(yǎng)時間對農(nóng)桿菌浸染效果的影響

3.2.4 預(yù)培養(yǎng)時間對農(nóng)桿菌侵染效果的影響

共培養(yǎng)后將愈傷組織轉(zhuǎn)至預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，利用頭孢霉素對外植體進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，同時也使愈傷組織恢復(fù)良好的生長狀態(tài).預(yù)培養(yǎng)的時間短，愈傷組織無法恢復(fù)生長而導(dǎo)致分化能力喪失；但預(yù)培養(yǎng)的時間也不能夠過長，培養(yǎng)10 d比7 d獲得的轉(zhuǎn)化苗數(shù)量少，可能的原因是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生長能力弱于非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因細(xì)胞增殖緩慢，進(jìn)而使轉(zhuǎn)基因植株獲得量迅速降低.從表5的結(jié)果來看，預(yù)培養(yǎng)的時間以5～7 d為最適宜.

表5 預(yù)培養(yǎng)時間對農(nóng)桿菌浸染效果的影響

3.2.5 篩選劑G418使用濃度和使用時間對轉(zhuǎn)基因篩選效果的影響

預(yù)培養(yǎng)后將愈傷組織轉(zhuǎn)到含G418的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，隨著不同質(zhì)量濃度的G418篩選時間的延長，水稻均表現(xiàn)出分化能力顯著下降，所以本實驗后期采用了高質(zhì)量濃度（200 mg／L）短時間篩選的辦法，以期既能達(dá)到篩選效果又可盡量降低對水稻分化率的影響，最后確定的篩選時間為7～10 d.

3.3 水稻轉(zhuǎn)基因植株的GFP和PCR檢測

本實驗共獲得40株轉(zhuǎn)化陽性植株（見圖3、圖4），GFP檢測結(jié)果見圖5，在熒光顯微鏡下觀察到葉片呈現(xiàn)強(qiáng)的綠色熒光為轉(zhuǎn)基因植株，紫紅色熒光則為非轉(zhuǎn)基因植株.提取水稻幼嫩葉片基因組總DNA，并以此為模板，根據(jù)NPTⅡ基因序列設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)化植株沒有外源目的條帶出現(xiàn)，轉(zhuǎn)化植株則能擴(kuò)增出550 bp的NPTⅡ基因片段，如圖6中條帶8與13，這與GFD的檢測結(jié)果一致.

圖3 侵染后分化的愈傷組織及獲得的植株

圖4 轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)化植株

圖5 轉(zhuǎn)基因植株GFP檢測圖

圖6 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測圖

4 結(jié)論

本研究利用已經(jīng)構(gòu)建的RNAi干擾載體TPAS對水稻進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化實驗，獲得了水稻陽性植株的最初材料，結(jié)果表明，水稻的遺傳轉(zhuǎn)化程序為：在農(nóng)桿菌浸染濃度D（600）＝0.2，侵染時間3 min，共培養(yǎng)2～4 d，預(yù)培養(yǎng)5～7 d，G418質(zhì)量濃度150～200 mg／L條件下篩選7 d，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到30%.

轉(zhuǎn)化后的水稻在農(nóng)藝性狀上表現(xiàn)出植株較高、生長期延長、分蘗減少、葉片細(xì)長等特征（見圖4），可能與轉(zhuǎn)化的基因有一定的關(guān)系.但TPAS轉(zhuǎn)化后對水稻生長的影響還需進(jìn)一步觀察，TPAS功能的研究還需進(jìn)行轉(zhuǎn)座子活性和基因組DNA的甲基化檢測才能進(jìn)一步確定.

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Specific RNAi vector construction of transposon Pong in rice andAgrobacteriumtumefaciens－mediated genetic transformation optimization

GAO Li－h(huán)ong1，2，ZHANG Chun－yu1，3，CHAI Na1，LU Yun－xia1，LIU Bao1，LIU Li－xia1

（1.School of Life Sciences，Changchun Teachers College，Changchun 130032，China；2.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China；3.Changchun Vocational Institute of Technology，Changchun 130033，China）

To study the function of rice transposon Pong，the research constructed the specific RNAi expressed vector TPAS of transposon Pong in rice，and transferred the vectors into the mature embryo callus of the rice cultivar Matsumae，and then obtained the regeneration of the positive PCR results byAgrobacteriumtumefaciens－mediated method.To establish and optimize genetic transformation process，the different infected ways，concentrations and time ofAgrobacteriumwere chosen.The result showed that：the infection time ofAgrobacteriumto mature embryo callus is 3 min，the time of coculture is 2～4 d，the pre－culture period is 7 d，all the dates were the best genetic transformation parameters，making the basis for the function of rice Tn Pong.

rice；transposon；RNAi；tumefaciens－mediated；genetic transformation

Q 943.2

180·7110

A

1000－1832（2011）04－0122－06

2011－06－12

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973）項目（2005CB120805）.

高立宏（1975—），女，博士研究生，講師；通訊作者：劉立俠（1959—），女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事植物分子遺傳研究

方 林）