田美紅，張海波，張英成

（1.東北師范大學(xué)體育學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130024；2.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院體育教研部，吉林長(zhǎng)春 130052）

人參果膠SB對(duì)免疫細(xì)胞因子分泌的雙向調(diào)節(jié)作用

田美紅1，張海波2，張英成1

（1.東北師范大學(xué)體育學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130024；2.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院體育教研部，吉林長(zhǎng)春 130052）

以人參中的重要活性成分——人參果膠為實(shí)驗(yàn)材料，研究分析了其對(duì)免疫細(xì)胞因子分泌的影響.結(jié)果表明，人參果膠SB對(duì)人單核細(xì)胞THP－1分泌細(xì)胞因子IL－8及對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL－2均具有明顯的雙向調(diào)節(jié)作用，即低濃度的人參果膠促進(jìn)免疫細(xì)胞因子的分泌，而高濃度的人參果膠卻呈現(xiàn)抑制作用.從細(xì)胞免疫學(xué)的角度初步揭示了人參的雙向調(diào)節(jié)作用機(jī)理.

人參；果膠；細(xì)胞因子

人參（PanaxginsengC.A.Mey）是我國(guó)的名貴中藥，具有多種藥效.目前對(duì)人參的各種成分，尤其是人參皂甙及其藥理活性國(guó)內(nèi)外研究得均很深入［1－4］.近年來(lái)，對(duì)人參中的另一種有效成分——人參多糖的研究與利用也取得了一定的進(jìn)展［5－12］.人參多糖主要由人參淀粉和人參果膠組成，其中具有藥理活性的部分主要是人參果膠，其生物活性主要體現(xiàn)在能顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫能力方面［5－8］.現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參是適應(yīng)原性藥物，具有雙向調(diào)節(jié)作用，即向著有利于機(jī)體功能恢復(fù)和加強(qiáng)的方向進(jìn)行調(diào)節(jié).本文利用生產(chǎn)人參精等制品后的人參根廢渣為原料，分離純化出人參果膠SB，通過(guò)測(cè)定其對(duì)人單核細(xì)胞THP－1及對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，初步揭示了人參雙向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)理.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 人參果膠

從提取人參皂甙后的人參根廢渣中分離純化得到人參果膠SB［9］.

1.2 細(xì)胞系

THP－1，人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，產(chǎn)品貨號(hào)：TCHu 57.

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL／6J純系小鼠，一級(jí)，體重18～20 g，購(gòu)自北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)基為RPMI－1640，添加10%胎牛血清，細(xì)胞在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng).在放射免疫實(shí)驗(yàn)中，將濃度為5×105個(gè)／m L的細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200μL，同時(shí)加入不同濃度的人參果膠樣品、LPS及PMA.24 h后，收集細(xì)胞，離心，用于細(xì)胞因子的定量測(cè)定.

2.2 細(xì)胞因子IL－8的同位素標(biāo)記

向EP管中加入10μL THP－1分泌細(xì)胞因子IL－8（1μg／μL），10μL磷酸鹽緩沖液（0.5 mol／L），5μL125I Na，4μL氯化銻.約10 s后，加入20μL焦亞硫酸鈉終止標(biāo)記反應(yīng).反應(yīng)液經(jīng)Sephadex G10柱層析分離，逐管收集流出液，放射免疫測(cè)定儀檢測(cè)，第一個(gè)峰即為125I標(biāo)記的細(xì)胞因子IL－8.

2.3 細(xì)胞因子IL－8的定量測(cè)定

采用放射免疫法.首先向EP管中分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)樣品100μL，然后加入細(xì)胞因子IL－8抗體100μL（抗體量相當(dāng)于可與24 h后加入的125I標(biāo)記的細(xì)胞因子IL－8的40%結(jié)合），最后加入0.3%兔血清300μL.24 h后，加入125I標(biāo)記的細(xì)胞因子IL－8 100μL.再過(guò)24 h后，加入700μL磷酸鹽緩沖液（含有6%聚乙二醇和2%羊抗兔IgG），10 min后，離心，棄上清，倒置過(guò)夜.24 h后，測(cè)定沉淀物的放射性強(qiáng)度，以濃度的對(duì)數(shù)值為X軸，放射性為Y軸，先繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后查出待測(cè)樣品中細(xì)胞因子IL－8的含量.

2.4 脾細(xì)胞IL－2的誘生及活性測(cè)定

2.4.1 脾細(xì)胞IL－2的誘生

分離小鼠脾臟并制備脾細(xì)胞懸液，懸浮液為RPMI－1640，細(xì)胞濃度為1×107個(gè)／m L.按每孔500μL的量加入細(xì)胞懸液至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中.然后分別加入不同濃度的人參果膠SB和終濃度為2.5μg／m L的Con A 500μL.37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，收集上清，4℃保存，待測(cè).

2.4.2 IL－2的活性測(cè)定

檢測(cè)采用小鼠脾T淋巴母細(xì)胞增殖分析法.在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1×107個(gè)／m L的小鼠脾細(xì)胞懸液（0.5 m L／孔）和5μg／m L的Con A（0.5 m L／孔），37℃，5%CO2條件下共培養(yǎng)48 h.將培養(yǎng)的細(xì)胞懸液滴于淋巴細(xì)胞分層液中（V細(xì)胞懸液∶V分層液＝（2～3）∶1），2 000 r／min離心20 min，中間層細(xì)胞即為T淋巴母細(xì)胞.將淋巴母細(xì)胞離心洗滌2次，用含10%小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，使懸液細(xì)胞的濃度為1×106個(gè)／m L.在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入誘生的IL－2上清液（100μL／孔）和配好的細(xì)胞懸液100μL／孔（3復(fù)孔），37℃，5%CO2培養(yǎng)42 h后，加入3H－Td R，繼續(xù)培養(yǎng)6 h.多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞，應(yīng)用液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定同位素?fù)饺肓浚Y(jié)果以3復(fù)孔的放射活性（cpm）的均值表示［13－14］.

3 結(jié)果

3.1 人參果膠SB對(duì)THP－1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL－8的影響

本實(shí)驗(yàn)使用了3個(gè)濃度的人參果膠SB對(duì)THP－1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL－8的影響情況進(jìn)行檢測(cè).放射免疫法測(cè)定結(jié)果表明，在培養(yǎng)基對(duì)照組中，低質(zhì)量濃度人參果膠SB（1μg／mL）沒(méi)有引起IL－8分泌的改變；但當(dāng)人參果膠SB的質(zhì)量濃度分別提高至10μg／m L及100μg／m L時(shí)，IL－8的分泌也隨之大幅增高至11倍及15倍，二者濃度表現(xiàn)為正相關(guān)性（見(jiàn)表1、圖1）.與之一致的是，在LPS和PMA的低刺激組中，隨著人參果膠SB的濃度逐漸提高，IL－8的分泌也逐漸增高（見(jiàn)表1、圖1）.然而，在LPS和PMA的高刺激組中，隨著人參果膠SB濃度的逐漸提高，IL－8的分泌卻呈現(xiàn)了顯著的抑制效應(yīng)（見(jiàn)表1、圖1）.

表1 人參果膠SB對(duì)THP－1細(xì)胞分泌IL－8的影響

3.2 人參果膠SB對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL－2的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)了3個(gè)濃度的人參果膠SB對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL－2的影響.結(jié)果顯示，在無(wú)Con A存在的條件下，低質(zhì)量濃度的人參果膠SB（1μg／m L）沒(méi)有表現(xiàn)出影響作用；而中高質(zhì)量濃度的人參果膠SB可以顯著促進(jìn)IL－2的產(chǎn)生，其濃度與小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL－2的能力呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性（見(jiàn)圖2）.當(dāng)Con A存在時(shí)，低質(zhì)量濃度的人參果膠SB（1μg／m L）具有顯著促進(jìn)IL－2產(chǎn)生的能力，而中高質(zhì)量濃度的人參果膠SB卻喪失了促IL－2生成作用（見(jiàn)圖2）.

1 人參果膠SB對(duì)THP－1細(xì)胞分泌因子IL－8的雙向調(diào)節(jié)

2 人參果膠SB對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌因子IL－2的雙向調(diào)節(jié)

4 討論

本文從細(xì)胞免疫學(xué)的角度，通過(guò)測(cè)定人參果膠SB對(duì)人單核細(xì)胞THP－1分泌細(xì)胞因子IL－8及對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL－2的影響，初步揭示人參的雙向調(diào)節(jié)作用機(jī)理.

在測(cè)定人參果膠SB對(duì)THP－1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL－8的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組和低刺激組中，人參果膠的濃度與其促IL－8生成的能力呈現(xiàn)顯著的正相關(guān).然而，在高刺激組中，人參果膠的濃度與其促IL－8生成的能力卻呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)，充分說(shuō)明了人參果膠具有明顯的雙向調(diào)節(jié)作用.IL－8是機(jī)體內(nèi)非常重要的趨化性細(xì)胞因子，由單核細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)中性粒細(xì)胞具有顯著的趨化和激活作用.IL－8的適量分泌可以引起短暫局部的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體殺滅細(xì)菌的能力.然而，如果IL－8生成過(guò)多，會(huì)促使過(guò)量的中性粒細(xì)胞被激活，從而導(dǎo)致機(jī)體的病理性炎癥損傷［15］.因此，人參果膠對(duì)IL－8的雙向調(diào)節(jié)可以理解為，當(dāng)細(xì)胞因子分泌量少、機(jī)體免疫力低下時(shí)，人參果膠可通過(guò)提高細(xì)胞因子的分泌達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的目的；當(dāng)高強(qiáng)度刺激導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌過(guò)量時(shí)，人參果膠又可通過(guò)抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，保護(hù)機(jī)體免受病理性的損傷.

在人參果膠SB對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL－2影響的實(shí)驗(yàn)中，也得到了類似的結(jié)果.即在無(wú)刺激條件下，較高濃度的人參果膠可以顯著促進(jìn)IL－2的產(chǎn)生；在高刺激條件下時(shí)，較高濃度的人參果膠失去了促IL－2生成的作用，再次證明了人參果膠具有良好的雙向調(diào)節(jié)作用.與IL－8不同，IL－2是由活化的T細(xì)胞分泌并可顯著促進(jìn)T細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子.在機(jī)體常態(tài)條件下，促IL－2分泌可提高機(jī)體的免疫力；但當(dāng)高強(qiáng)度刺激因素存在時(shí)，過(guò)量的IL－2分泌會(huì)引起機(jī)體免疫功能的紊亂，甚至導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生.因此，人參果膠的優(yōu)良特性使其能夠幫助機(jī)體朝著有利于功能加強(qiáng)和功能恢復(fù)的方向進(jìn)行調(diào)節(jié).

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The bidirectional regulation role ofPanaxginsengpectin SB on the production of cytokines

TIAN Mei－h(huán)ong1，ZHANG Hai－bo2，ZHANG Ying－cheng1

（1.School of Physical Education，Northeast Normal University，Changchun 130024，China；2.Teaching and Research Department of Sports，Jilin Teacher's Institute of Engineering and Technology，Changchun 130052，China）

Accumulating evidence shows that thePanaxginsengC.A.Mey have elegant bidirectional regulation role.However，the mechanism is still unclear.In this study，the pectin SB ofPanaxginsengwas tested as regulators of the production of cytokines.The results showed that the pectin SB have impressive bidirectional regulation role on the production of IL－8 secreted by THP－1 cells and the production of IL－2 secreted by mouse splenocytes i.e.the pectin SB with low concentration promotes the secretion of cytokines，but the pectin SB with high concentration exhibits the reverse effects，probably suggesting one of the mechanisms of the bidirectional regulation role of thePanaxginseng.

PanaxginsengC.A.Mey；pectin；cytokines

Q 539＋.8

180·1720

A

1000－1832（2011）04－0128－04

2011－06－09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39770847）；教育部重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2001235）.

田美紅（1972—），女，碩士，講師，主要從事運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)研究.

方 林）