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        基于核酸適配體-熒光染料EvaGreenTM快速檢測(cè)ATP的研究

        2011-12-26 14:03:58陳伶利賀氣志毛平道
        關(guān)鍵詞:染料孵育核酸

        陳伶利 ,李 杰 ,賀氣志 ,陳 輝 ,毛平道 ,鄧 樂(lè) *

        (1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410081;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410208)

        基于核酸適配體-熒光染料EvaGreenTM快速檢測(cè)ATP的研究

        陳伶利1,2,李 杰2,賀氣志1,陳 輝1,毛平道1,鄧 樂(lè)1*

        (1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410081;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410208)

        目的 利用熒光嵌入染料EvaGreenTM在單雙鏈DNA溶液中不同的熒光性質(zhì)構(gòu)建基于核酸適配體的ATP檢測(cè)體系,建立一種簡(jiǎn)單、高效的檢測(cè)ATP的新方法。方法 利用ATP核酸適配體雙鏈DNA(dsDNA)和核酸綠色熒光染料Eva GreenTM嵌合作用,實(shí)現(xiàn)了對(duì)ATP的檢測(cè)??疾炝薃TP的孵育溫度、pH、濃度等因素對(duì)熒光強(qiáng)度的影響,并對(duì)該方法的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果 反應(yīng)體系在12℃,pH 7.5條件下具有最佳實(shí)驗(yàn)效果,在最優(yōu)條件下,最低能檢測(cè)10-6mol/L的ATP,并具有較高的特異性。結(jié)論 本研究為ATP的快速檢測(cè)提供了一種易于操作、低成本的新方法。

        核酸適配體;EvaGreenTM;ATP;檢測(cè)

        腺嘌呤核苷三磷酸 (adenosine-triphosphate,ATP)在生物體與外界進(jìn)行物質(zhì)和能量交換的過(guò)程中,起著重要的橋梁、紐帶作用,它是生物體各種生命活動(dòng)能量的直接來(lái)源,因此在很多的生物反應(yīng)檢測(cè)中ATP是一項(xiàng)重要的檢測(cè)內(nèi)容[1-2]。目前,檢測(cè)ATP的方法主要有電泳法、光學(xué)分析法、層析法、生物發(fā)光法(熒光素酶法)等,但是以上方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí),且靈敏度不高;2009年 Li W等人提出用金納米粒子來(lái)檢測(cè)ATP,可以檢測(cè)到1~10mmol/L的ATP,大大提高了檢測(cè)靈敏度,但此方法需要制備特異的核酸修飾的金納米探針,檢測(cè)成本較高[3]。Huizenga和 Szostak于1995年通過(guò)SELEX技術(shù)篩選出ATP/Adenosine適配體[4],基于適配體技術(shù)的檢測(cè)研究受到了極大的關(guān)注[5-7]。2008年Zhang Chen等將量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體生物傳感器用于A(yíng)TP檢測(cè)[8],2009年孫波等用高靈敏適配體電化學(xué)發(fā)光生物傳感器來(lái)檢測(cè)血樣中的ATP[9],但是這些方法需要使用特殊試劑,分析成本較高。染料Eva GreenTM是一種綠色熒光核酸染料,它有良好的熱穩(wěn)定性和水解穩(wěn)定性,為常規(guī)操作提供了便利,而Eva GreenTM本身沒(méi)有熒光,與dsDNA嵌合后能發(fā)出高亮度的熒光,但當(dāng)dsDNA轉(zhuǎn)化為ssDNA后熒光強(qiáng)度將大大減弱。與熒光核酸染料SYBRTM GreenⅠ相比,E-va GreenTM可以在更高濃度下使用,從而產(chǎn)生更強(qiáng)的擴(kuò)增信號(hào)[10-12]。

        本研究以ATP為目標(biāo)分析物,以核酸適配體-ATP的特異性識(shí)別與dsDNA與熒光染料Eva GreenTM的嵌合作用為基礎(chǔ),發(fā)展了一種簡(jiǎn)單、靈敏的熒光檢測(cè)新技術(shù)。由于Eva GreenTM與dsDNA嵌合后能發(fā)出高亮度的熒光,但與ssDNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度大大減弱。利用核酸適配體-ATP復(fù)合物的形成所引起的熒光值變化來(lái)檢測(cè)ATP。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本方法操作簡(jiǎn)單,不需要對(duì)樣品進(jìn)行處理,檢測(cè)所需時(shí)間短,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以在40min內(nèi)完成。同時(shí)具有較高的靈敏性、較強(qiáng)的特異性,最低檢測(cè)下限為10~6 M;該方法的建立為ATP的分析檢測(cè)提供了新的技術(shù)支持?,F(xiàn)將方法與結(jié)果報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 儀器 LS50B型熒光分光光度計(jì)(PerkinElmer,美國(guó))。

        1.1.2 試劑 染料Eva GreenTM購(gòu)自北京美萊博醫(yī)學(xué)有限公司 (Biotium,美國(guó),20×),使用時(shí)稀釋20倍;ATP、GTP、CTP、UTP購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司(BBI公司);實(shí)驗(yàn)用水均為超純水;緩沖液為0.01moL/L 磷酸緩沖液 (PBS,pH 6.0~8.0), 均為115℃滅菌20min,冷卻后備用;所有序列(表1)均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成,PAGE純化。

        表1 ATP核酸適配體序列表

        1.2 實(shí)驗(yàn)原理

        本實(shí)驗(yàn)的分子識(shí)別與檢測(cè)原理如圖1所示:利用熒光嵌入染料EvaGreenTM在單雙鏈DNA溶液中不同的熒光性質(zhì)構(gòu)建了基于核酸適配體的ATP檢測(cè)體系。由于綠色熒光染料Eva GreenTM與dsDNA的嵌合作用,系統(tǒng)產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)dsDNA與ATP孵育后,ATP能識(shí)別其特異適配體,并形成適配體-ATP復(fù)合物,使DNA雙鏈解鏈,嵌合的熒光染料Eva GreenTM得以釋放,從而導(dǎo)致系統(tǒng)熒光信號(hào)驟然減弱,通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)熒光信號(hào)變化強(qiáng)度可定量測(cè)定ATP的濃度。

        圖1 核酸適配體-ATP復(fù)合物熒光信號(hào)傳感技術(shù)原理示意圖

        1.3 方法

        1.3.1 dsDNA制備 取10μmol的ATP核酸適配體溶液與10μmol/L的互補(bǔ)序列等量混和,4℃過(guò)夜,即得10μmol/L的含ATP適配體的dsDNA。

        1.3.2 適配體與ATP相互作用 取10μmol的dsDNA 5 μL于1.5 mL EP管中,再分別加入0.01moL/L PBS(pH 7.5)589 μL,不同濃度 ATP 6 μL,對(duì)照管以等體積PBS代替ATP。于12℃孵育1 h。

        1.3.3 熒光值的檢測(cè) 分別取與ATP孵育后的溶液及對(duì)照管溶液各197.5 μL,并加入 2.5 μL Eva GreenTM,振蕩10min后在熒光分光光度計(jì)上分別測(cè)其熒光值,調(diào)激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

        2 結(jié)果

        2.1 孵育溫度對(duì)于熒光強(qiáng)度的影響

        反應(yīng)溫度對(duì)適配體與ATP的結(jié)合能產(chǎn)生一定的影響。將dsDNA與ATP反應(yīng)體系置于不同溫度下反應(yīng),檢測(cè)熒光信號(hào)變化值,確定該反應(yīng)的最佳孵育溫度。室溫(約12℃)為最佳的孵育溫度。溫度較低或較高時(shí),dsDNA的解鏈不完全,與其嵌合的熒光染料Eva GreenTM釋放量少,從而檢測(cè)到的熒光信號(hào)變化不顯著,見(jiàn)圖2。

        2.2 不同pH值對(duì)于熒光強(qiáng)度的影響

        圖2 孵育溫度對(duì)熒光影響強(qiáng)度的柱形分析圖

        在反應(yīng)體系中,不同的pH值的PBS緩沖液對(duì)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)也具有顯著的影響。在空白熒光為489.38 的條件下,pH 6.0、 6.5、 6.8、 7.0、 7.3、7.5、8.0所測(cè)得的熒光值分別為 358.02、288.04、276.34、266.83、236.64、183.26、226.04 au,實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次,取平均值。該結(jié)果表明:pH值為7.5時(shí),反應(yīng)檢測(cè)所得的熒光強(qiáng)度最低,即熒光變化值最大,說(shuō)明在pH 7.5時(shí),緩沖液對(duì)反應(yīng)體系的影響最小。這是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度的變化決定于Eva GreenTM的釋放量,而Eva GreenTM的釋放量又受適配體-ATP結(jié)合程度的影響,而pH值能夠影響適配體-ATP復(fù)合物的解離,在pH 7.5時(shí),適配體-ATP復(fù)合物的解離程度最小,因此該pH是本反應(yīng)體系的最適值,見(jiàn)圖3。

        圖3 pH值對(duì)熒光強(qiáng)度檢測(cè)影響的散點(diǎn)分析圖

        2.3 線(xiàn)性范圍及檢出下限

        考察了ATP的濃度對(duì)于反應(yīng)體系熒光信號(hào)檢測(cè)的影響。在空白熒光為489.38,背景信號(hào)為13.57的條件下,隨著ATP濃度的減小,所測(cè)得的熒光信號(hào)與空白對(duì)照的變化值越來(lái)越小,當(dāng)ATP濃度為10-7mol/L時(shí),所測(cè)結(jié)果與10-6mol/L變化很小,趨近為零,說(shuō)明對(duì)10-7mol/L的檢測(cè)無(wú)意義,見(jiàn)圖4。

        2.4 ATP特異性檢測(cè)

        圖4 ATP濃度對(duì)于熒光強(qiáng)度影響的散點(diǎn)分析圖

        為了檢驗(yàn)本體系對(duì)ATP檢測(cè)的特異性,實(shí)驗(yàn)還考察了不同濃度的其他同類(lèi)型NTP分子,即CTP、GTP、UTP分子。將NTP分子與實(shí)驗(yàn)所用的核酸適配體在相同條件下反應(yīng),并檢測(cè)它們的熒光信號(hào)變化值。實(shí)驗(yàn)測(cè)得dsDNA的起始熒光強(qiáng)度為481。通過(guò)4組不同濃度NTP分子檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比,隨著濃度的變化,對(duì)照組CTP、GTP、UTP的熒光信號(hào)有緩慢上升的趨勢(shì),但變化不明顯。這是因?yàn)镃TP、GTP、UTP在結(jié)構(gòu)上與ATP存在一定的相似性,能與ATP適配體存在一定程度的結(jié)合,因而釋放出少量的染料,使熒光信號(hào)出現(xiàn)少量變化。而在實(shí)驗(yàn)組隨著ATP濃度的減小,熒光強(qiáng)度有明顯增大,也就是說(shuō)隨著ATP濃度的減小,熒光信號(hào)變化值也變小。以上結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的熒光傳感技術(shù)對(duì)于A(yíng)TP分子檢測(cè)具有較高的特異性,見(jiàn)圖5。

        圖5 ATP特異性檢測(cè)折線(xiàn)圖

        3 討論

        本研究基于核酸適配體-ATP復(fù)合物與綠色熒光染料Eva GreenTM作用,建立了熒光信號(hào)檢測(cè)技術(shù)的新方法。

        本研究?jī)?yōu)化了核酸適配體與ATP結(jié)合反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,核酸適配體與ATP反應(yīng)的最適溫度為12℃;pH值為7.5時(shí),熒光檢測(cè)結(jié)果最靈敏;在最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,隨著ATP濃度的減小,所測(cè)得的熒光信號(hào)與空白對(duì)照的變化值變小,當(dāng) ATP 濃度從 10-6mol/L 到 10-2mol/L 變化,對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度隨著濃度的減小而增大,呈現(xiàn)一定的線(xiàn)性關(guān)系。因此可作為該范圍濃度的ATP檢測(cè)新方法。體系還對(duì)該方法的特異性作出了探討,采用與ATP同類(lèi)型分子CTP、GTP、UTP作為對(duì)照,根據(jù)檢測(cè)出的結(jié)果證實(shí)該核酸適配體對(duì)與ATP分子的檢測(cè)具有較強(qiáng)的特異性。

        本研究所建立的基于核基于核酸適配體-ATP特異識(shí)別的熒光傳感技術(shù),對(duì)于A(yíng)TP分子的檢測(cè)相較于其他的檢測(cè)方法,不僅反應(yīng)體系特異性高,并且實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,耗時(shí)少,成本低??梢?jiàn),本研究為之后的分子識(shí)別檢測(cè)提供了更為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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        Study of rapid detecting ATP based on aptamer and DNA-specific dye EvaGreenTM

        CHEN Ling-li,LI Jie,HE Qi-zhi,CHEN Hui,MAO Ping-dao1,DENG Le
        (College of Life Science,Hunan Normal University,Changsha,Hunan 410081,China)

        Aptamer;Eva GreenTM;ATP;detection

        Q-331

        B

        10.3969/j.issn.1674-070X.2011.05.002.006.04

        〔Absrract〕Objective To develop a simple,efficient fluorescence detection technology for ATP.Methods The DNA-intercalating dye Eva GreenTMaptamer-ATP complex was used to detect quickly ATP.The effects of temperature,concentration,pH and reaction time were studied.Results The reacting system was that the best temperature and pH were 12℃and pH7.5,The ATP at limitation 10~6moL/L was detected with optimized conditions.Conclusion This research provides a kind of easy operation and low cost method for ATP rapid detection.

        2011-01-06

        國(guó)家科技部863計(jì)劃資助項(xiàng)目(2007AA062Z403)。

        陳伶利(1979-),女,湖南株洲人,博士,主要從事病原微生物檢測(cè)技術(shù)研究。

        *鄧 樂(lè),男,教授,博士研究生導(dǎo)師,E-mail:dengle@hunnu.edu.cn。

        (本文編輯 彭芝配)

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