白 瑤, 張育輝, 翟麗麗, 李忻怡, 楊 君, 洪燕燕

(陜西師范大學 生命科學學院, 陜西 西安 710062)

雙酚A誘導雄性中國林蛙肝細胞雌激素受體表達和卵黃蛋白原合成

白 瑤, 張育輝*, 翟麗麗, 李忻怡, 楊 君, 洪燕燕

(陜西師范大學 生命科學學院, 陜西 西安 710062)

為探討雙酚A(bisphenol A, BPA)對雄性兩棲動物肝細胞中雌激素受體(estrogen receptor, ER)表達和卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)合成的影響, 將中國林蛙(Rana chensinensis)雄性成體分別持續(xù)暴露于 10-7、10-6、10-5mol/L BPA水體中10、20、30 d, 設10-9、10-8mol/L雌二醇(E2)為陽性對照。用原位雜交技術檢測ER mRNA在肝細胞中的表達定位，用免疫組織化學技術檢測肝細胞中ER和VTG蛋白的表達。結(jié)果顯示, 各BPA和E2處理組肝細胞中均有ER mRNA陽性反應, ER和VTG蛋白的表達相對值均顯著高于空白對照組。在同一暴露時間, ER和VTG表達值是隨著BPA濃度的增加呈增高趨勢。在同一BPA濃度, VTG表達值是隨暴露時間的延長呈增高趨勢, 而ER表達值則無顯著性變化。這些表明BPA可以通過誘導雄性中國林蛙肝細胞的ER高調(diào)導致VTG合成, 但其效應遠低于E2。

雙酚A; 肝細胞; 雌激素受體; 卵黃蛋白原; 中國林蛙

內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)是指干擾機體正常的內(nèi)分泌機能, 并影響其生長、發(fā)育、繁殖和行為的外源性化學物質(zhì)。EDCs可通過影響激素的合成、分泌、包裝、結(jié)合和轉(zhuǎn)運等影響人和動物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)、生殖、發(fā)育和行為。雙酚A(bisphenol A, BPA)作為化工原料, 被廣泛應用于聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂等高分子材料的生產(chǎn)過程中。已有研究報道, BPA屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一。

雌激素受體(estrogen receptor, ER)與雌激素結(jié)合參與啟動雌激素應答元件轉(zhuǎn)錄, 使雌激素發(fā)揮效應。ER的水平也可間接反映外源性化學物質(zhì)是否具有雌激素效應(Yamaguchi et al, 2005)。在卵生脊椎動物, 卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)受內(nèi)源性雌激素的調(diào)節(jié), 在肝細胞中合成并釋放到血液中。雄性卵生脊椎動物在外源雌激素的誘導下也可合成VTG。因此, 雄性動物體內(nèi)卵黃蛋白原的異常生成可作為一種生物標志物檢測環(huán)境化學污染的雌激素效應(Andrew et al, 2007)。

BPA對水生動物ER和VTG的影響已有報道,將非洲爪蟾(Xenopus laevis)蝌蚪暴露于BPA水體可誘導雌性比例升高, 體內(nèi) ER mRNA表達高調(diào)(Levy et al, 2004)。魚類在一定濃度范圍的BPA水體暴露后, 肝臟 ER mRNA表達水平也增高(Yamaguchi et al, 2005; Seo et al, 2006)。這些均表明BPA可誘導肝細胞ER的表達增加。另外, 在雄性爪蟾(X. laevis)和歐洲林蛙(Rana temporaria)BPA暴露處理后(Bogi et al, 2003), 給雄性東方鈴蟾(Bombina orientalis)注射BPA后(Gye & Kim, 2005),動物肝細胞中VTG mRNA的表達量均增加。在魚類也有相似的研究結(jié)果(Sohoni et al, 2001;Lindholst et al, 2003)。上述研究結(jié)果可見, BPA誘導雄性卵生動物肝細胞的VTG合成可能與高調(diào)ER相關, 但這些報道對VTG和ER的檢測大多數(shù)都不在同一動物完成。本實驗將雄性中國林蛙(Rana chensinensis)暴露于BPA水體后, 同時檢測肝細胞中ER和VTG表達, 探討B(tài)PA對雄性兩棲動物肝細胞中ER和VTG表達的影響及其兩者之間的關系, 從而深入理解BPA對雄性兩棲動物產(chǎn)生的雌激素效應。

1 材料與方法

1.1 材料

BPA 的純度＞98%(上?；瘜W試劑公司); E2為17β-雌二醇(Sigma公司); ER一抗為ER α兔抗鼠多克隆抗體(Santa Cruz公司); VTG一抗為兔抗魚多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色劑(Boster 公司);堿性磷酸酶偶聯(lián)抗 DIG抗體、NBT/BCIP顯色劑(Roche公司); 焦碳酸二乙酯(DEPC)、山羊血清(Sigma 公司)。

中國林蛙(Rana chensinensis)于2008年10月采自秦嶺北坡的西安市長安大峪水庫附近。選取雄性成體育齡蛙108例, 體重為6.72～7.21g。

1.2 暴露實驗

按照爪蟾的BPA暴露濃度(Iwamuro et al, 2003),將雄性林蛙隨機分為 6組, 包括 10-7、10-6、10-5mol/L BPA, 用10-9和10-8mol/L E2處理作為陽性對照組, 用自來水作為空白對照。每組放置6例, 設3個重復。實驗室水族箱飼養(yǎng), 每箱加曝氣72 h以上的自來水2 L, 水深浸沒全部蛙體, 每48 h換水一次。用面包蟲飼喂, 每日保證12 h光照。

分別暴露10、20、30 d后, 每組每次取6例麻醉后剖腹, 取部分肝臟用中性福爾馬林溶液固定24 h, 供ER和VTG的免疫組織化學檢測; 另取部分肝臟用4%多聚甲醛溶液固定24 h, 供ER的原位雜交檢測。常規(guī)石蠟切片, 厚8 μm, 裱在涂有0.05%多聚賴氨酸處理的載玻片上, 室溫干燥24 h, 37 ℃烘片48 h, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 原位雜交檢測

依據(jù)美洲豹蛙(Rana pipiens)雌激素受體α(estrogen receptor α)(DQ398027)和非洲爪蟾(X. laevis)雌激素受體 α1(estrogen receptor α1) (LOC398734)基因的保守區(qū)域設計地高辛標記的探針, 反義探針序列為：5'-CATTCCCACTTCATAGCATTTTCTGAGT CGGCAGGCTTGACA -3'。

主要步驟：常規(guī)脫蠟、復水; 0.1% DEPC處理;0.1 mol/L甘氨酸/PBS漂洗; 0.3%TritonX-100/ PBS浸片; 2.5 mg/mL胃蛋白酶37 ℃消化; 4%多聚甲醛固定; 0.25%乙酸酐浸片; 37 ℃預雜交液孵育; 0.2×SSC漂洗; 42 ℃雜交24 h; 4×SSC 42 ℃漂洗; 37 ℃分別用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC漂洗; 緩沖液-1(0.1 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L NaCl, pH7.5)漂洗;山羊血清封閉液37 ℃孵育; 抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復合物 37 ℃孵育; 緩沖液-2(0.1 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L MgCl2, pH7.5)漂洗; 緩沖液-3(0.1 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L NaCl,0.05 mol/L MgCl2, pH9.5)漂洗; 加顯色液避光顯色;緩沖液-4(0.01 mol/L Tris-HCl, 0.001 mol/L EDTA,pH8.1)漂洗; 常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢、拍照。陰性對照采用正義探針的稀釋液代替探針孵育, 其余步驟相同。

鏡檢陽性反應產(chǎn)物的標準：在胞質(zhì)和核膜上藍色顆粒為陽性, 陰性對照為無色。

1.4 免疫組織化學檢測

常規(guī)SABC法：切片常規(guī)脫蠟、復水; 3%H2O2浸片10 min; 0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)微波修復15 min; PBS漂洗3×5 min; 山羊血清室溫封閉20 min; 分別加ER或VTG一抗, 濕盒中4 ℃孵育過夜; PBS漂洗 3×5 min; 滴加生物素化羊抗兔IgG, 37 ℃孵育 30 min; PBS漂洗 3×5 min; 滴加SABC復合物, 37 ℃孵育30 min; PBS漂洗4×5 min;DAB顯色5 min。常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢、拍照。陰性對照用抗體稀釋液代替一抗孵育, 其余步驟相同。

鏡檢陽性反應產(chǎn)物的標準：胞質(zhì)和胞核內(nèi)棕黃色顆粒明顯深于背景底色為陽性, 陰性對照為無色。

1.5 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計分析

每組取 6例樣本, 每例做 3張切片, 用 Leica CAMER圖像采集系統(tǒng)(Lecia Qwin V3)采集圖像。用Image-Pro Plus 6.0軟件對免疫組織化學陽性產(chǎn)物進行半定量檢測, 測定視野中 30個細胞陽性免疫反應的光密度值, 著色程度越深, 光密度值越大。以光密度值作為陽性反應產(chǎn)物表達相對值。

用 Kolmogorov-Smirnov檢驗所得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后, 將 BPA和 E2的濃度作為處理因子進行單因素方差分析(one way-ANOVE), 顯著性水平設置為α=0.05。同一濃度不同處理時間的多重比較采用Duncan檢驗。各組數(shù)據(jù)均用Mean±SD表示, 所有數(shù)據(jù)處理和制圖均使用SPSS 16.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1 BPA暴露后ER mRNA及ER在肝細胞的表達

2.1.1 ER mRNA在肝細胞的表達 原位雜交法檢測顯示, BPA和E2處理后肝細胞核膜和胞質(zhì)中均存在 ER陽性反應, 呈藍色。對照組胞質(zhì)中陽性反應著色很淺, 胞核無陽性反應(圖 1-1)。BPA 處理組中ER陽性反應著色相對較淺(圖1-2), 而E2處理組胞核和胞質(zhì)中陽性顆粒相對較多, 顏色較深(圖1-3)。

2.1.2 ER在肝細胞的表達 免疫組織化學檢測顯示, 對照組肝細胞中 ER陽性反應較弱(圖 1-4), 在各BPA處理組的肝細胞中ER陽性反應產(chǎn)物呈較淺的棕黃色片狀或顆粒狀(圖1-5), 在E2處理組, 肝細胞的ER陽性反應產(chǎn)物為較深的棕黃色(圖1-6)。

圖1 林蛙雙酚A暴露后雌激素受體和卵黃蛋白原在肝細胞的陽性反應Fig. 1 Positive effect of ER and VTG on hepatocytes of Rana chensinensis exposed to BPA

ER陽性反應表達相對值的半定量統(tǒng)計結(jié)果顯示(圖2), 與相同處理時間的對照組相比, 10-7mol/L BPA處理組中肝細胞的 ER表達相對值顯著增高(P＜0.05), 10-6、10-5mol/L BPA和E2處理組的ER增高極顯著(P＜ 0.01), 即BPA和E2在處理時間相同時,ER隨著BPA和E2濃度的升高顯著上調(diào)。

圖2 雙酚A暴露后林蛙肝細胞中雌激素受體表達相對值的比較Fig. 2 Comparisons on relative intensity of ER expression in hepatocytes of Rana chensinensis exposed to BPA

比較不同處理時間的 ER表達相對值, 對照組在10、20和30 d的ER表達值差異不顯著(P＞0.05)。BPA各處理組暴露10、20、30 d后, ER表達值差異也不顯著(P＞0.05)。但在10-8mol/L E2組, 暴露30 d與10、20 d相比, ER表達值是顯著增高(P＜0.05); 在10-9mol/L E2組暴露20、30 d, 與10 d相比, ER表達值是顯著降低(P＜0.05)。從總體趨勢上看, ER表達值不隨暴露時間的延長而增加。

2.2 BPA暴露后VTG在肝細胞的表達

在各BPA和E2處理組, 肝細胞中均有VTG表達, VTG陽性反應在胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒狀或片層狀(圖1-8, 9), 對照組無明顯的陽性反應(圖1-7)。

VTG陽性反應表達相對值的半定量統(tǒng)計結(jié)果顯示(圖3), 與相同處理時間的對照組相比, 各BPA和E2處理組肝細胞的VTG陽性反應的表達值均顯著增高。其中10-7mol/L BPA處理10、20 d時, VTG表達值增高顯著(P＜0.05), 其余各組增高是極顯著(P＜0.01), 可見VTG表達隨著BPA和E2濃度的增高有增加趨勢。

圖3 雙酚A暴露后林蛙肝細胞中卵黃蛋白原表達相對值比較Fig. 3 Comparisons of the relative intensity of VTG expression in hepatocytes of R. chensinensis exposed to BPA

在不同處理時間, 對照組在 10、20、30 d的VTG 反應變化不顯著(P＞0.05)。在處理組, 10-5mol/L BPA暴露 20 d, VTG表達相對值顯著增加(P＜0.05), 但在 30 d時又顯著降低(P＜0.05)。10-6mol/L BPA暴露30 d, VTG表達值較10 d顯著增加(P＜0.05)。10-7mol/L BPA暴露30 d, VTG表達值較10、20 d 顯著增加(P＜0.05)。10-8mol/L E2暴露 20、30 d, VTG表達值較 10 d顯著增加(P＜0.05); 10-9mol/L E2組的VTG表達值均較前一時期顯著增加(P＜0.05)。

3 討 論

3.1 BPA對雄性林蛙肝細胞ER表達的影響

ER是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子, 通過雌激素應答元件調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。E2在靶細胞中與 ER結(jié)合為 E2-ER復合物, 再與雌激素反應元件結(jié)合,可啟動或改變基因的轉(zhuǎn)錄。E2可誘導肝細胞 ER mRNA的表達, 進而可誘導 VTG雌激素反應元件的表達(Pakel, et al, 1991; Klinge, 2001)。

BPA為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物, 具有雌激素樣效應。BPA的雌激素效應與ER的活化相關, 其機制包括導致ER上調(diào)、雌激素結(jié)合蛋白以及內(nèi)源雌激素的合成和分泌的改變, BPA又可通過與ER的結(jié)合改變雌激素反應的基因表達(Bowman et al, 2002;Andrew et al, 2007)。在新生雄性大鼠, BPA可使精原細胞或精母細胞內(nèi)的ER表達, 被認為是BPA誘導ER mRNA的表達水平升高(Takao et al, 2003)。BPA水體暴露可誘導爪蟾(X. laevis)蝌蚪體內(nèi)ER mRNA的水平明顯升高, 蝌蚪雌性比例升高(Levy et al, 2004)。用不同濃度BPA暴露處理雄性青鳉(Oryzias latipes)和花斑溪鳉(Rivulus marmoratus),肝臟ER mRNA表達水平的上升依賴于一定范圍的BPA 濃度(Yamaguchi et al, 2005; Seo et al, 2006)。這些表明 BPA可誘導 ER的表達, 從而發(fā)揮雌激素效應。在本實驗, 對雄性中國林蛙進行 BPA和E2暴露后, 原位雜交檢測結(jié)果顯示的ER mRNA與免疫組織化學檢測的ER表達細胞定位一致。對ER表達相對值的測定可見, 在相同的處理時間, ER表達是隨著 BPA和 E2處理濃度的升高而顯著上調(diào),表明BPA和E2誘導ER的表達高調(diào)的作用相似, 可啟動ER基因轉(zhuǎn)錄。隨著BPA和E2暴露時間的延長, 肝細胞的 ER表達未呈現(xiàn)一直增高的趨勢。這說明機體在外源性激素或激素樣化合物的作用下,ER的表達水平仍存在自身的調(diào)節(jié)機制, 其合成不會無節(jié)制地增加(Bowman et al, 2002)。

比較BPA與E2的雌激素活性, 據(jù)報道, BPA與ER的結(jié)合能力僅是 E2的 1/2 000(Krishnan et al,1993), BPA 引起效應的量通常為 E2的 103～105倍(Matthews et al, 2001; Kloas et al, 2000)。本實驗所采用的BPA濃度范圍比E2高2～3個數(shù)量級, 而E2處理組的 ER表達值仍高于 BPA 處理組, 表明 BPA雖然與E2同樣可高調(diào)ER表達, 但BPA的雌激素效應遠低于E2。

3.2 BPA對雄性林蛙肝細胞中VTG的影響

VTG是卵生動物卵黃蛋白的前體, VTG基因?qū)儆诖萍に貞鹪? E2-ER結(jié)合可啟動其轉(zhuǎn)錄(Pakel et al, 1991; Denslow et al, 2001)。正常雄性個體的體內(nèi)很少或不產(chǎn)生VTG, 但在外源性雌激素或類似物的誘導下, 卵生動物的雄性個體或幼體的肝細胞也可合成VTG(Denslow et al, 1999; Mitsui et al, 2007)。用BPA處理雄性非洲爪蟾(X. laevis)的原代培養(yǎng)肝細胞, 表明VTG mRNA的表達與BPA劑量和時間存在依賴關系(Kloas et al, 1999)。雄性東方鈴蟾(Bombina orientalis)注射 BPA, 可誘導肝臟 VTG mRNA的表達(Gye & Kim, 2005)。在魚類, 對雄性黑頭呆魚(Pimephales promelas)、虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)進行BPA水體暴露, VTG合成量是隨著暴露時間的延長而增加(Sohoni et al,2001; Lindholst et al, 2003)。本實驗所選用BPA和E2的暴露濃度為顯著效應濃度, 在短時間內(nèi)能誘導雄性林蛙肝細胞中VTG的生成。對VTG表達相對值的測定可見, 在相同的處理時間, VTG合成量是隨BPA和E2濃度的升高而增加, 表明VTG的合成與BPA和E2的作用密切相關。在處理濃度相同時,隨著BPA和E2暴露時間的延長, VTG在肝細胞中的表達量也呈現(xiàn)增高趨勢。這些實驗均顯示, BPA可誘導雄性卵生動物肝細胞 VTG 的合成, 其合成量對雌激素或類雌激素的劑量和處理時間存在依賴關系。但是, 本實驗中10-5mol/L BPA組處理30 d后, VTG表達水平有所降低, 可能是由于林蛙長時間處于較高濃度的BPA水體中, 體內(nèi)的BPA量積累較多, 導致肝細胞受損, 從而影響 VTG合成功能。類似現(xiàn)象在尖頭鱥(Phoxinus oxycephalus)的BPA暴露水體中也被報道(Park et al, 2003)。

有關BPA的雌激素效應濃度, 在BPA處理小鼠胚胎的實驗表明, 10-8～10-6mol/L BPA 可產(chǎn)生雌激素效應, 而10-4mol/L BPA卻起抑制作用(Takai et al, 2000)。用 10-4mol/L BPA對歐洲林蛙(R.temporaria)原代培養(yǎng)的肝細胞處理后, 其VTG的合成沒有發(fā)生變化, 其原因被解釋為BPA與ER的結(jié)合能力很弱(Rouhani et al, 2005)。本實驗中BPA水體暴露所采用的濃度范圍為10-7～10-5mol/L, 與多數(shù)暴露實驗所采用的 BPA濃度及所得到的結(jié)果相近?？梢夿PA只有在一定的濃度范圍內(nèi)才可發(fā)揮較強的雌激素活性。而上述用 10-4mol/L BPA在細胞培養(yǎng)中沒有引起相應的激素效應效果的原因,是屬于處理方式的差異還是處理濃度過高, 有待探討。

有關BPA誘導ER表達高調(diào)和VTG異常合成的機制, 通過對雄性虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)肝細胞離體培養(yǎng)研究表明, 外源雌激素可上調(diào) ER的表達, 同時使 VTG mRNA 的表達增加, 認為VTG mRNA的表達依賴于ER的水平(Flouriot et al,1997)。通過BPA對MCF-7細胞的雌激素效應研究認為, BPA的作用途徑主要通過ER介導, BPA濃度過高則與 ER的結(jié)合達到飽和, 將不能檢測到濃度改變所引起的效應(Welshons et al, 2003)。本實驗在一定的BPA濃度范圍暴露處理雄性中國林蛙, 肝細胞的ER表達和VTG合成均隨BPA濃度增大呈現(xiàn)增高趨勢, 表明VTG的表達依賴于ER的水平, BPA可能通過誘導ER途徑促使VTG合成。VTG可隨著BPA暴露時間的延長增高, 但ER的表達未隨時間的延長發(fā)生顯著變化。BPA具有與 E2相似的雌激素效應, 但其效應遠低于E2。

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Estrogen receptor expression and vitellogenin synthesis induced in hepatocytes of male frogsRana chensinensisexposed to bisphenol A

BAI Yao, ZHANG Yu-Hui*, ZHAI Li-Li, LI Xin-Yi, YANG Jun, HONG Yan-Yan

(College of Life Science,Shaanxi Normal University,Xi’an710062,China)

The effects of bisphenol A (BPA) on estrogen receptor (ER) and vitellogenin (VTG) in hepatocytes of male amphibians have attracted significant attention in recent years. Adult male frogsRana chensinensiswere exposed to different concentrations of 10-7, 10-6and 10-5mol/L BPA consecutively for 10, 20, and 30 d, respectively. We used 10-9,10-8mol/L 17β-esradiol (E2) as positive controls. The expressions of ER mRNA in the hepatocytes were detected byin situhybridization, and ER and VTG protein were detected by immunohistochemistry. The results showed that positive effects of ER mRNA were detected in all BPA and E2treatment groups. Compared with the control group, the expression level of ER and VTG protein increased significantly in the hepatocytes ofR. chensinensis. Both ER and VTG expression exhibited BPA dose-dependence for the same exposure time. For the same concentration of BPA treatment, VTG synthesis markedly increased with prolonged treatment, whereas the expression of ER did not significantly fluctuate. It is suggested that BPA caused the synthesis of VTG by inducing ER up-regulation in the hepatocytes of maleR. chensinensis,but its estrogenic activity was much lower than E2.

Bisphenol A; Hepatocytes; Estrogen receptor; Vitellogenin;Rana chensinensis

X174; Q959.53

A

0254-5853-(2011)03-0317-06

10.3724/SP.J.1141.2011.03317

2010-06-29；接受日期：2011-04-02

國家自然科學基金資助項目(30770243)

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: yu-huizhang@163.com