張秀娟, 李學(xué)家, 夏機良, 顏孫興, 季 芳, 張艷春, 劉曉明,, 彭白露,,*

(1. 廣東省昆蟲研究所， 廣東 廣州 510260； 2. 廣東藍島生物技術(shù)有限公司， 廣東 廣州 510555)

中老年食蟹猴群中糖尿病相關(guān)基因的表達狀態(tài)

張秀娟1, 李學(xué)家1, 夏機良1, 顏孫興2, 季 芳1, 張艷春1, 劉曉明1,2, 彭白露1,2,*

(1. 廣東省昆蟲研究所， 廣東 廣州 510260； 2. 廣東藍島生物技術(shù)有限公司， 廣東 廣州 510555)

該研究選擇10歲以上健康中老年食蟹猴138只, 按空腹血糖值(FPG)將其分為低血糖組、血糖正常組和高血糖組。采用全自動血液生化儀分別檢測各組血清中總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平變化; 采用熒光定量PCR分析食蟹猴外周血白細胞中37個糖尿病相關(guān)基因的mRNA表達情況。結(jié)果表明, 血清血脂水平HDL-C、LDL-C、TCHO和TG都與FPG分組無顯著相關(guān)性(P＞0.05), 而外周血白細胞中ACE、ACLY、PRKCB1、SLC2A4、SNAP23、VAPA、IGF2BP2、IFNG8個基因的mRNA表達水平隨FPG的升高而顯著上調(diào)(P＜0.05)。

食蟹猴; 血脂; 外周血白細胞; 糖尿病; 基因表達

糖尿病是一種慢性代謝性疾病, 其中90%以上的患者為2型糖尿病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO, 2009)估計, 全世界有超過2.2億的糖尿病患者, 2030年可能會增加到3.6億。糖尿病已成為僅次于癌癥、心腦血管病的人類第三大疾病。

2型糖尿病患者容易引發(fā)各種并發(fā)癥, 如糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變等, 而且糖尿病是導(dǎo)致心血管疾病最重的因素之一。目前, 我國主要將空腹血糖、糖耐量2 h血糖，以及隨機血糖水平作為診斷糖尿病的依據(jù)。新近, 美國糖尿病協(xié)會(ADA)提出新增糖化血紅蛋白(HbAlc)≥6.5%作為診斷糖尿病新標準, 將 HbAlc處于 5.7%～6.4%之間者以及空腹血糖受損和糖耐量受損的個體統(tǒng)稱為糖尿病風(fēng)險增高人群。然而, 上述指標很難檢測糖尿病的早前期,鑒于糖尿病的高危害性和難治愈性, 因此, 需要尋找新的糖尿病早前期診斷方法和技術(shù), 以便對糖尿病進行更早發(fā)現(xiàn)和更早防治。

隨著人們對糖尿病發(fā)病機理的不斷認識, 從分子生物學(xué)水平對糖尿病的早期診斷和風(fēng)險預(yù)警已有可能。若能掌握糖尿病相關(guān)基因在糖尿病發(fā)病進程中的表達模式, 再結(jié)合血糖等常規(guī)檢測指標, 有望更好地對糖尿病進行風(fēng)險預(yù)警和早期診斷。近年來, 有研究糖尿病相關(guān)基因的多態(tài)性來預(yù)測糖尿病風(fēng)險(Jeon et al, 2010); 外周血白細胞中基因表達情況可間接反映個體糖尿病狀況(Kaizer et al, 2007;Takamura et al, 2007; Jin et al, 2011)。

非人靈長類動物食蟹猴的生物學(xué)特性、生理、遺傳、解剖特征等與人非常相似。Tigno et al(2004)發(fā)現(xiàn)自發(fā)性2型糖尿病食蟹猴, 在發(fā)病過程中也經(jīng)歷與人類2型糖尿病相似的胰島素抵抗、糖代謝異常和高胰島素血癥等階段。近年來, 食蟹猴越來越多地被用于糖尿病相關(guān)研究中。為了調(diào)查一些糖尿病相關(guān)基因與糖尿病發(fā)病病程關(guān)系, 本研究以 138只中老年食蟹猴為主要研究對象, 以空腹血糖(FPG)為分組依據(jù), 檢測其常規(guī)血液生化指標。同時, 采用熒光定量 PCR分析其外周血白細胞中糖尿病相關(guān)基因的表達情況與FPG的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇 10歲以上中老年健康、普通飼養(yǎng)的食蟹猴共計138只(其中雄性65只, 雌性73只), 廣東藍島生物技術(shù)有限公司提供食蟹猴。

1.2 血清生化指標的測定與實驗動物分組

血清樣本的采集：食蟹猴禁食14～16 h后, 隱靜脈采血3 mL, 置于促凝管中, 室溫放置30 min,4 000 r/min離心20 min分離血清, 立即檢測FPG、TCHO、TG、HDL-C和LDL-C五項指標(日立7020全自動生化分析儀)。

實驗動物分組：以中老年食蟹猴FPG為因變量,對FPG進行正態(tài)分布檢驗, 剔除極值, FPG數(shù)值基本接近于正態(tài)分布。參考本實驗室對食蟹猴血糖值的調(diào)查分析(Hao et al, 2011), 本研究根據(jù)FPG值將研究對象分為三組, 即低血糖組(第Ⅰ組)(FPG＜3.20 mmol/L)、血糖正常組(第Ⅱ組)(3.20 mmol/L≤FPG＜5.50 mmol/L)和高血糖組(第Ⅲ組)(FPG≥5.50 mmol/L)。

1.3 提取外周血白細胞總RNA及其cDNA的制備

股靜脈采血 3 mL置于含肝素抗凝管中, 將其與15 mL紅細胞裂解液(Ma et al, 2007)(1.6 mmol/LEDTA, 10 mmol/L KHCO3, 153 mmol/L NH4C1,pH 7.4)混勻, 冰上放置 30 min, 201 g離心 5～10 min收集外周血白細胞, Trizol法(Invitrogen)提取外周血白細胞總RNA, 通過凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量, 并計算其濃度。取大約 0.5 μg RNA, 用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA, 所得 cDNA 于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR反應(yīng)

37個糖尿病相關(guān)基因可在食蟹猴外周血白細胞中有效表達(郝香芬, 待發(fā)表), 因此, 本研究采用熒光定量PCR檢測這37個糖尿病相關(guān)基因在中老年食蟹猴外周血白細胞中的 mRNA表達狀況。這37個基因按功能分為如下6類：

代謝酶類：ACE、ACLY、G6PD、GSK3B、HMOX1、IDE、PRKCB1、PYGL; 受體、通道和運輸?shù)鞍最悾篈QP2、CCR2、CEACAM1、CTLA4、GCGR、ICAM1、NSF、RAB4A、SELL、SLC2A4、SNAP23、STX4、STXBP2、TNFRSF1A、VAMP3、VAPA; 分泌因子類：AGT、IFNG、INS、TNF; 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類：IGFBP5、PIK3C2B、PIK3R1、IκBα; 轉(zhuǎn)錄因子類：NEUROD1、PPARGC1、IGF2BP2; 肥胖相關(guān)：CDKN2B、FTO。

以GAPDH作內(nèi)參(Sluimer et al, 2007), 所有糖尿病相關(guān)基因和內(nèi)參的 PCR產(chǎn)物長度均在 200～300 bp之間。采用SYBR GreenⅠ染料(TaKaRa)在Applied Biosystems StepOne? Real-Time PCR System上進行熒光定量PCR, 熒光定量PCR為20μL 反應(yīng)體系：10 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(2×),0.4 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L), 0.4 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L), 2 μLcDNA, 7.2 μL ddH2O。熒光定量PCR反應(yīng)步驟：(1)95 ℃, 30 s;(2)95 ℃, 5 s; 60 ℃, 34 s, 共 40 個循環(huán); (3)溶解曲線分析采用系統(tǒng)默認設(shè)置(即95 ℃, 15 s; 60 ℃ , 1 min;95 ℃ , 15 s; 60 ℃, 15 s; 速度為 1.6 ℃/s)。所有基因PCR產(chǎn)物均純化回收, 并測序驗證, 并將測序結(jié)果與華大基因食蟹猴數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)基因比對驗證。所有熒光定量PCR反應(yīng)均重復(fù)三次。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

采用 Applied Biosystems StepOne? Software v2.1對熒光定量PCR結(jié)果進行初步分析, 以低血糖組為參照樣本, 2—△△Ct法分析各基因的相對表達量,相關(guān)數(shù)據(jù)以±S表示。用軟件SPSS17.0單因素方差分析(one-way ANOVA),P＜0.05認為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 中老年食蟹猴血清血糖與血脂的關(guān)系

本研究分析了4個脂代謝相關(guān)血液生化指標與FPG水平的關(guān)系(表1), 統(tǒng)計結(jié)果表明, FPG在3組之間差異極顯著(P＜0.01), 而 HDL-C、LDL-C、TCHO和TG都與FPG無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

2.2 糖尿病相關(guān)基因在中老年食蟹猴中的表達分析

去除無擴增熒光信號、溶解曲線差、Ct＜ 8或Ct＞ 35及△Ct＞13的熒光定量PCR反應(yīng), 采用2－△△CT法計算各基因相對于低血糖組食蟹猴中相應(yīng)基因的表達量, 結(jié)果如表2、3所示。在高能量膳食誘導(dǎo)的小批量食蟹猴的全病程糖尿病模型中可檢測到有 37個糖尿病相關(guān)基因有效表達(郝香芬, 待發(fā)表), 其中每個基因均有其獨特的表達模式(在不同的發(fā)病階段中有不同的表達狀態(tài))。然而, 可能由于個體遺傳差異造成在大樣本群體中的集合, 使某一基因的表達狀態(tài)在群體中出現(xiàn)較寬的分布。為便于對糖尿病風(fēng)險程度的評估, 我們將這一分布狀態(tài)劃分為高表達水平、中等表達水平和低表達水平。

表1 不同F(xiàn)PG組與4個血生化指標的統(tǒng)計分析(x±S) (mmol/L)Tab. 1 Statistical analysis of different FPG groups and four blood lipid biochemical indicators(x±S)

表2 與FPG顯著相關(guān)的8個糖尿病相關(guān)基因的相對表達量分析(x±S)Tab. 2 Relative expression analysis of eight diabetes related genes significantly associated with FPG(x±S)

表3 29個糖尿病相關(guān)基因在中老年食蟹猴群中的相對表達量分析(x±S)Tab. 3 Relative expression analysis of 29 diabetes-associated genes in middle or aged cynomolgus monkeys (x±S)

續(xù)表

續(xù)表

從表2、3可以得出, 37個糖尿病相關(guān)基因的總體平均表達水平普遍存在標準偏差比較大的現(xiàn)象,經(jīng) SPSS17.0軟件統(tǒng)計分析獲得ACE、ACLY、PRKCB1、SLC2A4、SNAP23、VAPA、IGF2BP2、IFNG等8個基因的總體表達水平隨空腹血糖的升高而顯著上調(diào)(P＞0.05), 詳見表 2。而其他基因的表達模式與FPG分組無顯著相關(guān)性(詳見表3)。各個基因按照基因表達量的正態(tài)分布將食蟹猴群分為三類表達水平方式, 數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示此三類表達水平隨FPG的表達趨勢與總體平均表達趨勢呈現(xiàn)一致。

3 討 論

目前臨床上主要以血糖為檢測糖尿病的主要指標, 而 2型糖尿病臨床前期癥狀隱匿, 從正常血糖到間歇餐后高血糖, 最后發(fā)展到持續(xù)性空腹高血糖, 從無糖尿到有糖尿, 從無癥狀到有癥狀、無并發(fā)癥到有并發(fā)癥, 一般要經(jīng)歷一段比較長的時間。目前關(guān)于糖尿病風(fēng)險預(yù)警和早期診斷的方法和手段, 主要是根據(jù)種族、年齡、腰圍、腰臀圍比、血壓、糖尿病家族史、飲食和運動習(xí)慣等制成危險因素計量表, 或根據(jù)口服葡萄糖耐量試驗、餐后血糖、空腹胰島素及糖化血紅蛋白對糖尿病風(fēng)險進行預(yù)測。新公布的2010年版《中國2型糖尿病防治指南》仍采用口服葡萄糖耐量試驗對糖尿病前期人群進行篩查。因此, 利用現(xiàn)有臨床檢測手段很難對糖尿病進行早發(fā)現(xiàn)、早治療。

2型糖尿病在發(fā)病進程中會出現(xiàn)糖脂代謝異常。大量研究表明, 其中HDL-C就是一個重要指標,50%的胰島素抵抗的2型糖尿病患者和妊娠期糖尿病患者都存在 HDL-C水平顯著降低(Ledet et al,1979; Bartha et al, 2000), 降低的HDL-C進而通過一系列的信號通路來降低 LDL-C對內(nèi)皮介導(dǎo)的血管擴張作用的抑制(Matsuda et al, 1993), 故HDL-C具有抗動脈粥樣硬化作用, 并與心血管疾病的發(fā)生呈負相關(guān)。HDL-C還可以保護β細胞免受膽固醇對其的損傷、應(yīng)激引起的細胞凋亡和胰島炎癥的發(fā)生,從而可能作為一種藥物來預(yù)防和治療 T2DM(Kruit et al, 2010)。本研究雖然也統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)在中老年食蟹猴群中隨著血糖水平的升高, HDL-C水平有不斷減低的趨勢, 但卻無統(tǒng)計意義上的顯著差異(P＞0.05),而TCHO、LDL-C和TG無變化趨勢和統(tǒng)計相關(guān)性,在正常波動范圍內(nèi), 這說明了通過檢測與糖尿病高度相關(guān)的傳統(tǒng)臨床檢測指標, 也無法為2型糖尿病風(fēng)險預(yù)警找到合適的參考指標。

外周血白細胞取材方便, 對機體無創(chuàng)傷性傷害,是一種理想的臨床診斷材料。本研究所采用的熒光定量PCR方法具有較高的靈敏性, 一些在外周血白細胞中表達豐度較低的基因都被檢測到, 這為進一步的研究這些基因在 T2DM 發(fā)病進程中的表達變化提供了有利的工具。本研究以傳統(tǒng)臨床檢測指標——空腹血糖值為主要分組依據(jù), 檢測并分析了37個糖尿病相關(guān)基因在隨機抽取的中老年食蟹猴中的表達與 FPG水平的相關(guān)性, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ACE、ACLY、PRKCB1、SLC2A4、SNAP23、VAPA、IGF2BP2、IFNG等8個基因的表達水平隨空腹血糖的升高而顯著上調(diào)(P＜0.05)。這些基因在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中都有著重要的作用(Vassilopoulos et al, 2009;Zeggini et al, 2007), 如 ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACLY)位于細胞質(zhì), 是糖代謝一關(guān)鍵基因, 依賴ATP將檸檬酸裂解為乙酰輔酶A。研究表明, ACLY活性水平對葡萄糖誘導(dǎo)胰島素分泌有重要促進作用( MacDonald et al, 2009; Guay et al,2007), 在 T2DM 患者的胰島中該酶活性和 mRNA水平較正常人顯著減低(約 55%)(MacDonald et al,2009), 而在本研究中發(fā)現(xiàn)在食蟹猴血液樣本中血糖高組該基因表達水平上調(diào), 這是一個很有趣的現(xiàn)象, 可能與糖代謝紊亂時期、表達組織不同或人猴差異有關(guān), 我們對該基因在糖尿病發(fā)病進程中的表達模式還在進一步的關(guān)注中。

本研究是對中老年食蟹猴群體的血液樣本中37個糖尿病相關(guān)基因的表達狀態(tài)進行的分子生物學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明, 在傳統(tǒng)生化指標難以對正常食蟹猴進行糖尿病風(fēng)險評估時, 我們卻可從個體的糖尿病相關(guān)基因的表達狀態(tài)發(fā)現(xiàn)其潛在的糖尿病風(fēng)險信息。如果這些信息與群體自發(fā)或誘發(fā)的糖尿病每一階段結(jié)果相對應(yīng), 則可從中遴選出健康預(yù)期和糖尿病風(fēng)險預(yù)警的部分候選指標。

Bartha JL, Comino-Delgado R, Martinez-Del-Fresno P, Fernandez-Barrios M, Bethencourt I, Moreno-Corral L. 2000. Insulin-sensitivity index and carbohydrate and lipid metabolism in gestational diabetes [J].J Reprod Med,45(3): 185-189.

Guay C, Madiraju SR, Aumais A, Joly E, Prentki M. 2007. A role for ATP-citrate lyase, malic enzyme, and pyruvate/citrate cycling in glucose-induced insulin secretion [J].J Biol Chem, 282(49): 35657-35665.

Hao XF, Wang YL, Li XJ, Ji F, Peng BL, Rao JH, Liu XM. 2011. The investigation of the basal glucose in cynomolgus [J].Sichuan J Zool,[郝香芬, 萬玉玲, 李學(xué)家, 季芳, 彭白露, 饒軍華, 劉曉明. 2011.食蟹猴的基礎(chǔ)血糖值調(diào)查[J]. 四川動物, 30(1): 111-114.]

Jeon JP, Shim SM, Nam HY, Ryu GM, Hong EJ, Kim HL, Han BG. 2010.Copy number variation at leptin receptor gene locus associated with metabolic traits and the risk of type 2 diabetes mellitus [J].BMC Genomics11: 426.

Jin LS, Hao XF, Peng BL, Zhang YC, Wan YL, Ji F, Xia JL, Liu XM. 2011.Differential expression of six obesity-related genes with different disease phases of T2DM cynomolgus monkey [J].Zool Res,32(1):50-55.[靳麗莎, 郝香芬, 彭白露, 張艷春, 萬玉玲, 季芳, 夏機良, 劉曉明. 2011. 六個肥胖相關(guān)基金在食蟹猴2型糖尿病不同發(fā)病時期的差異表達[J]. 動物學(xué)研究, 32(1):50-55.]

Kaizer EC, Glaser CL, Chaussabel D, Banchereau J, Pascual V, White PC.2007. Gene expression in peripheral blood mononuclear cells from children with diabetes [J].J Clin Endocrinol Metab,92(9): 3705-3711.

Kruit JK, Brunham LR, Verchere CB, Hayden MR. 2010. HDL and LDL cholesterol significantly influence β-cell function in type 2 diabetes mellitus [J].Curr Opin Lipidol, 21(3): 178-185.

Ledet T, Neubauer B, Christensen NJ, Lundbaek K. 1979. Diabetic cardiopathy [J].Diabetologia,16(4): 207-209.

Ma J, Dempsey AA, Stamatiou D, Marshall KW, Liew CC. 2007.Identifying leukocyte gene expression patterns associated with plasma lipid levels in human subjects [J].Atherosclerosis,191(1): 63-72.

MacDonald MJ, Longacre MJ, Langberg EC, Tibell A, Kendrick MA,Fukao T, Ostenson CG. 2009. Decreased levels of metabolic enzymes in pancreatic islets of patients with type 2 diabetes [J].Diabetologia,52(6): 1087-1091.

Matsuda Y, Hirata K, Inoue N, Suematsu M, Kawashima S, Akita H,Yokoyama M. 1993. High density lipoprotein reverses inhibitory effect of oxidized low density lipoprotein on endothelium-dependent arterial relaxation [J].Circ Res,72(5): 1103-1109.

Sluimer JC, Kisters N, Cleutjens KB, Volger OL, Horrevoets AJ, van den Akker LH, Bijnens AP, Daemen MJ. 2007. Dead or alive: gene expression profiles of advanced atherosclerotic plaques from autopsy and surgery [J].Physiol Genomics,30(3): 335-341.

Takamura T, Honda M, Sakai Y, Ando H, Shimizu A, Ota T, Sakurai M,Misu H, Kurita S, Matsuzawa-Nagata N, Uchikata M, Nakamura S,Matoba R, Tanino M, Matsubara K, Kaneko S. 2007. Gene expression profiles in peripheral blood mononuclear cells reflect the pathophysiology of type 2 diabetes [J].Biochem Biophys Res Commun,361(2): 379-384.

Tigno XT, Gerzanich G, Hansen BC. 2004. Age-related changes in metabolic parameters of nonhuman primates [J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci,59(11): 1081-1088.

Vassilopoulos S, Esk C, Hoshino S, Funke BH, Chen CY, Plocik AM,Wright WE, Kucherlapati R, Brodsky FM. 2009. A role for the CHC22 clathrin heavy-chain isoform in human glucose metabolism [J].Science,324(5931): 1192-1196.

Zeggini E, Weedon MN, Lindgren CM, Frayling TM, Elliott KS, Lango H,Timpson NJ, Perry JR, Rayner NW, Freathy RM, Barrett JC, Shields B,Morris AP, Ellard S, Groves CJ, Harries LW, Marchini JL, Owen KR,Knight B, Cardon LR, Walker M, Hitman GA, Morris AD, Doney AS,McCarthy MI, Hattersley AT. 2007. Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes[J].Science,316(5829): 1336-1341.

Expression status of diabetes-associated genes in middle and aged cynomolgus monkeys

ZHANG Xiu-Juan1, LI Xue-Jia1, XIA Ji-Liang1, YAN Sun-Xing2, JI Fang, ZHANG Yan-Chun,LIU Xiao-Ming1,2, PENG Bai-Lu1,2,*

(1.Guangdong Entomological Institute,Guangzhou510260,China; 2.GuangDong Landau Biotechnology Co.,LTD,Guangzhou510555,China)

A total of 138 middle and aged cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) (above 10 years) were classified into three groups based on fasting plasma glucose (FPG) values, specifically low FPG, normal FPG, and high FPG group. Total cholesterol (TCHO), triglycerides (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) were detected in blood by automatic biochemical analyzer. The mRNA expressions of 37 diabetes-associated genes were analyzed with Real-time PCR in monocytes isolated from monkey peripheral blood. No significant correlation between the four serum lipid indictors HDL-C, LDL-C, TCHO, TG and FPG (P＞0.05) were found. However, the expressions ofACE,ACLY,PRKCB1,SLC2A4,SNAP23,VAPA,IGF2BP2, andIFNGwere significantly enhanced when FPG increased (P＜0.05).

Cynomolgus monkey; Serum Lipid; Peripheral blood leucocytes; Diabetes; Gene expression

R587.1; Q959.848; R-332

A

0254-5853-(2011)03-0300-07

10.3724/SP.J.1141.2011.03300

2011-02-17；接受日期：2011-04-19

國家“十二五”科技支撐計劃研究項目(2011ZX093073-024)； 廣州市重大科技專項項目(2010U1-E00811)；廣東省自然科學(xué)基金項目（10451026001004520）

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: pengbailu@hotmail.com

張秀娟(1979－)， 女， 研究方向：靈長類實驗動物學(xué)； E-mail: hallen6424@tom.com