黃 豐, 鄧華明, 朱苗苗, 肖 飛, 楊 麗, 張在軍, 肖 瑛, 聶 紅

(1. 暨南大學 藥學院中藥藥理教研室, 廣東 廣州 510632; 2. 暨南大學 醫(yī)學院藥理教研室, 廣東 廣州 510632;3. 暨南大學 藥學院中藥學教研室, 廣東 廣州 510632; 4. 暨南大學 藥學院新藥研究所, 廣東 廣州 510632)

阿魏酸對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)的抑制作用

黃 豐1,*, 鄧華明1, 朱苗苗1, 肖 飛2, 楊 麗3, 張在軍4, 肖 瑛4, 聶 紅1

(1. 暨南大學 藥學院中藥藥理教研室, 廣東 廣州 510632; 2. 暨南大學 醫(yī)學院藥理教研室, 廣東 廣州 510632;3. 暨南大學 藥學院中藥學教研室, 廣東 廣州 510632; 4. 暨南大學 藥學院新藥研究所, 廣東 廣州 510632)

阿魏酸是川芎、當歸等中藥的有效成分之一, 具有較強的抗氧化活性和抗炎作用。小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)常駐的免疫效應(yīng)細胞, 極易被激活而導(dǎo)致腦內(nèi)發(fā)生慢性神經(jīng)性炎癥反應(yīng), 與阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。該研究采用脂多糖(LPS)刺激小膠質(zhì)細胞(BV-2)活化, 研究阿魏酸對炎癥反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明, 2.5～22.5 μg/mL的阿魏酸濃度依賴性的抑制一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、白介素-1β(IL-1β)等炎癥因子的產(chǎn)生, 以及一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)蛋白的表達, 其作用機制可能與其抑制Toll樣受體4(TLR4)表達有關(guān)。

阿魏酸; 脂多糖; 小膠質(zhì)細胞; 神經(jīng)性炎癥; 阿爾茨海默病

小膠質(zhì)細胞(Microglia, MG)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)中, 約占神經(jīng)膠質(zhì)細胞總數(shù)的19%, 發(fā)揮內(nèi)源性免疫防御作用。在病理條件下, 其介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)是阿爾茨海默病(Alzheimer s disease, AD)等神經(jīng)退行性病變的重要病理特征之一。因此, 抑制小膠質(zhì)細胞活化對治療AD等神經(jīng)退行性疾病具有重要意義。阿魏酸(ferulic acid, FA)是當歸、川芎、升麻等中藥的有效成分之一, 具有抑制小膠質(zhì)細胞活化和多種炎癥因子表達的作用(Kim et al, 2004; Jin et al, 2008), 但阿魏酸抑制小膠質(zhì)細胞活化的機制, 尚待進一步研究。

AD的炎癥模型主要建立在細胞模型上, 通過致炎因子或缺氧缺血條件誘導(dǎo)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。利用LPS激活小膠質(zhì)細胞建立AD等神經(jīng)退行性疾病的炎癥模型是國際上公認的造模手段。本研究采用LPS刺激具原代的小膠質(zhì)細胞形態(tài)學、表型以及各項功能特點的 BV-2細胞株, 建立炎癥模型, 研究阿魏酸對炎癥反應(yīng)的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料和儀器

BV-2細胞株購自北京協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心;阿魏酸、吲哚美辛(indometacin, INDO)購自廣州市藥檢所; 脂多糖、地塞米松(dexamethasone, DEX)、氨基胍(aminoguanidine, AG)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自美國Sigma公司; TLR4抑制劑MST510購自美國eBioscience公司; BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)選擇性抑制劑 NS-398購自江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所;RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司; 胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司; 噻唑藍(methylthiazoletetrazolium, MTT)購自美國 Axygen公司; 一氧化氮(nitric oxide, NO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所; 白細胞介素-1β(interleukin1β,IL-1β)、前列腺素 E2(prostaglandin E2, PGE2)ELISA試劑盒購自美國 R&D公司; 兔抗鼠的 COX-2、β-actin多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology;兔抗鼠的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)多克隆抗體購自美國 BD 公司; 兔抗鼠的TLR4多克隆抗體、過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔多克隆抗體購自美國Santa cruz公司; 各種生化試劑(Tris-Base、SDS、甘氨酸、過硫酸胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tween20等)均為美國Amersco公司進口分裝; 預(yù)染marker購自加拿大MBI Fermentas公司;PVDF膜購自美國Millipore公司; 脫脂奶粉購自美國Difco公司; 20X LumiGLO(R) Reagent and 20X Peroxide 化學發(fā)光液購自美國 Cell Signaling Technology; CO2培養(yǎng)箱(美國Shellab公司); 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠); 全波長多功能酶標儀(奧地利TZCAN公司); 倒置顯微鏡(日本Nikon公司); 垂直電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)印槽、電泳儀和電源(美國Bio-rad公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

實驗用小鼠小膠質(zhì)細胞株 BV-2為貼壁細胞,置于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清, 100 U/mL青霉素, 100 U/mL鏈霉素)中, 于37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 根據(jù)細胞代謝情況, 1～2 d換液, 至指數(shù)生長期備用。

1.3 MTT法測阿魏酸對BV-2細胞活性的影響

將指數(shù)生長期的 BV-2細胞配制成細胞懸液接種于96孔板, 密度為5×104個/mL, 待細胞貼壁后,分別加入不同濃度的阿魏酸(0.83、2.5、7.5、22.5、67.5 μg/mL)孵育24 h后, 棄掉上清液, 加培養(yǎng)基作用24 h后棄上清液, 加入10 μL的MTT, 90 μL培養(yǎng)基孵育4 h后, 棄上清, 加入150 μL的DMSO, 充分震蕩使結(jié)晶溶解后, 于 570 nm 下測各孔的 OD值。實驗中分別設(shè)立對照孔(不加藥物的細胞空白孔)和調(diào)零孔(不接種細胞空白孔), 每組設(shè)6個復(fù)孔, 細胞的存活率(%)=1?〔(對照孔?調(diào)零孔)?(實驗孔?調(diào)零孔)〕/(對照孔?調(diào)零孔)×100 %。

1.4 硝酸還原酶法檢測阿魏酸對NO的抑制作用

取指數(shù)生長期的細胞配制成細胞懸液, 分別接種于 24 孔板中, 5×105個/mL, 每孔 1 000 μL, 設(shè)正常組, DMSO組, LPS組, 阿魏酸藥物組(2.5、7.5、22.5 μg/mL), 吲哚美辛藥物組(4 μg/mL), 氨基胍藥物組(11 μg/mL)。待細胞貼壁后, 加入各濃度藥物預(yù)孵育1 h后, 加入100 ng/mL LPS刺激12 h后檢測NO的生成量, 按照南京建成 NO檢測試劑盒說明書操作。

1.5 酶聯(lián)免疫法測阿魏酸對 IL-1β、PGE2的抑制作用

取指數(shù)生長期的細胞配制成細胞懸液, 分別接種于 24 孔板中, 5×105個/mL, 每孔 1 000 μL, 設(shè)正常組, DMSO組, LPS組, 阿魏酸藥物組(2.5、7.5、22.5 μg/mL), 吲哚美辛藥物組(4 μg/mL), NS-398(3 μg/mL)藥物組, 地塞米松藥物組(4 μg/mL)。待細胞貼壁后, 加入各濃度藥物預(yù)孵育 1 h后, 加入 100 ng/mL LPS刺激24 h后檢測IL-1β、PGE2的表達量,按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.6 免疫印記法檢測阿魏酸對 iNOS、COX-2、TLR4蛋白表達的影響

取指數(shù)生長期的 BV-2細胞接種于 6孔板中,5×105個/mL, 每孔 1 000 μL。待細胞貼壁后, 加入各濃度藥物預(yù)孵育1 h后, 加入100 ng/mL LPS刺激12 h后, 棄上清, 用預(yù)冷的PBS洗滌3次, 加100 μL的RIPA裂解液, 冰上作用30 min后, 用細胞刮把細胞刮下, 12 000×g, 4 ℃離心15 min, 將上清液移到1.5 mL的EP管中進行蛋白定量和免疫印記。蛋白定量根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行。各實驗組取等量蛋白20 μg進行電泳分析。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上, 用含 5%脫脂奶粉的TBST(10 mmol /L Tris-HC1, pH 7.5, 150 mmol/L NaC1, 1% Tween-20)于室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。然后分別與抗iNOS、COX-2、TLR4抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜, 洗脫一抗后與二抗(1∶2 000)孵育1 h, 洗脫二抗后采用發(fā)光液作用1 min后, 通過X-膠片顯影、定影。

1.7 統(tǒng)計學分析

各項實驗重復(fù)三次, 使用 SPSS13.0中的 Oneway ANOVA 中的Bonferroni Test 進行多個樣本間的兩兩比較,P＜0.05 為結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 阿魏酸對BV-2細胞活性的影響

由圖1的結(jié)果可知, 濃度為0.83～67.5 μg/mL的阿魏酸組的細胞活力分別為 98.5%、96.9%、99.4%、100.5%、97.1%。與正常組相比, 細胞活力無統(tǒng)計學差異。這說明在該濃度范圍內(nèi)阿魏酸對細胞活性無明顯影響。以下實驗將采用 2.5～22.5 μg/mL的濃度范圍。

圖1 阿魏酸對BV-2細胞的活性的影響Fig. 1 Cytotoxicity effects of FA on BV-2 cells

2.2 阿魏酸抑制NO的生成

NO由神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化所產(chǎn)生的炎癥因子之一, 是神經(jīng)性炎癥的一個重要檢測指標。實驗采用硝酸還原酶法檢測阿魏酸對LPS誘導(dǎo)BV-2細胞生成的NO的影響。圖2A結(jié)果顯示, LPS組的NO生成量顯著性高于正常組, 增量為 156.34%。DMSO組與正常組相比，無顯著性差別。與 LPS組相比,2.5～22.5 μg/mL的阿魏酸呈濃度依賴性降低NO的產(chǎn)生, 其抑制率分別為 9.66%、22.43%、41.27%。非甾體類抗炎藥物吲哚美辛(INDO)和iNOS選擇性抑制氨基胍(AG)均顯著性抑制NO的生成, 抑制率分別為47.77%和56.17%。

圖2 阿魏酸對LPS誘導(dǎo)BV-2生成NO(A)、PGE2(B)和 IL-1β(C)的影響Fig. 2 Effect of FA on LPS-induced NO (A),PGE2 (B), IL-1β (C) production in BV-2 cells

2.3 阿魏酸抑制PGE2的表達

PGE2作為主要的炎癥介質(zhì), 在 AD等神經(jīng)退行性疾病的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用。本實驗應(yīng)用PGE2 ELISA試劑盒檢測不同濃度阿魏酸對PGE2表達的影響。圖2B結(jié)果顯示, LPS組的PGE2表達顯著性高于正常組的表達量, 增加678%。DMSO組與正常組相比無顯著性差別。與LPS組相比, 2.5～22.5 μg/mL阿魏酸對PGE2的抑制率分別為：10.5%、20.9%、39.2%, PGE2表達顯示呈濃度依賴降低。非甾體類抗炎藥物吲哚美辛(INDO)和COX-2選擇性抑制NS-398均顯著性抑制PGE2的生成, 抑制率分別為51.9%和72.3%。

2.4 阿魏酸抑制IL-1β的表達

IL-1β是神經(jīng)性炎癥反應(yīng)中的重要的炎癥因子之一, 能啟動細胞因子惡性循環(huán), 最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大。因此, 抑制 IL-1β的表達對保護神經(jīng)細胞具有重要意義。

本實驗應(yīng)用IL-1β ELISA試劑盒檢測不同濃度阿魏酸對IL-1β表達的抑制作用。圖2C結(jié)果顯示,LPS組的 IL-1β表達顯著性高于正常組的表達量,增加 252.5%。DMSO組與正常組相比，無顯著性差別。與LPS組相比, 2.5～22.5 μg/mL阿魏酸濃度依賴降低IL-1β的表達, 其抑制率分別為：10.2%、30.4%、49.1%?？寡最愃幬锏厝姿?DEX)和吲哚美辛(INDO)均顯著性抑制 IL-1β的生成, 抑制率分別為59.9%和56.9%。

2.5 阿魏酸抑制iNOS、COX-2蛋白的表達

iNOS和COX-2分別是NO和PGE2生成的限速酶, 正常時無表達或表達量低, 在LPS等多種神經(jīng)毒性物質(zhì)刺激下, 表達量增加, 并促使 NO和PGE2的生成。

本實驗采用 Western blotting檢測了 iNOS、COX-2蛋白的表達。AG為iNOS的抑制劑, NS-398為 COX-2抑制劑。圖 3A、3B結(jié)果顯示, 正常組iNOS和 COX-2蛋白表達量極少, 經(jīng) LPS刺激后,iNOS、COX-2蛋白表達量明顯上調(diào), 阿魏酸可以抑制iNOS、COX-2蛋白表達, 并呈濃度依賴性。

2.6 阿魏酸抑制TLR4蛋白的表達

為了進一步探討阿魏酸抑制 LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的分子機制, 本實驗采用 Western blotting檢測了TLR4蛋白的表達。MST510為TLR4抑制劑, 圖3C結(jié)果顯示, 正常組TLR4表達量極少,LPS組的TLR4蛋白表達量較正常組明顯增加, 阿魏酸可以抑制TLR4蛋白表達, 并呈濃度依賴性。

圖3 阿魏酸對iNOS(A)、COX-2(B)、TLR4(C)蛋白表達的影響Fig. 3 Effect of FA on LPS-induced expression of iNOS(A)、COX-2(B)、TLR4(C)protein

3 討 論

在AD等神經(jīng)退行性病變的發(fā)生和發(fā)展過程中,小膠質(zhì)細胞發(fā)揮著“雙刃劍”的作用。在炎癥的初期, 小膠質(zhì)細胞通過吞噬作用清除病原微生物和死亡的細胞以維持腦內(nèi)的平衡。隨著AD等神經(jīng)退行性病變的發(fā)展, 活化的小膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子,部分炎癥因子會與小膠質(zhì)細胞表面的受體結(jié)合, 如Toll/IL-1受體(Toll/IL-1 receptor , TIR), 進一步激活小膠質(zhì)細胞, 形成惡性正反饋環(huán)路, 使得腦內(nèi)的慢性炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大(Rothwell & Luheshi, 2000;Eitan et al, 2009)。所以, 尋找能減少腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的藥物, 具有十分重要的意義。由于阿魏酸具有較強的抗炎活性, 因此, 我們通過體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞建立神經(jīng)性炎癥模型, 研究阿魏酸對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞活化所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的抑制作用, 并重點探討阿魏酸抑制小膠質(zhì)細胞活化的分子機制。

作為腦內(nèi)主要的免疫效應(yīng)細胞, 小膠質(zhì)細胞發(fā)揮著類似巨噬細胞的功能, 在受到刺激時易被激活,分泌大量的炎癥因子。NO雖然是多種生理功能的重要調(diào)節(jié)分子, 但在AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程中, 大量的NO是造成神經(jīng)細胞損傷死亡的重要炎癥因子之一, NO可導(dǎo)致宿主細胞和鄰近細胞的損傷。iNOS是NO生成過程中最主要的限速因子, 是炎癥中的一種反應(yīng)性酶類, 其表達不但是反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增生的標志之一, 還與神經(jīng)元損傷有關(guān), 正常時無表達或表達量低, 在LPS等多種神經(jīng)毒性物質(zhì)刺激下, 表達量增加, 從而導(dǎo)致 NO的產(chǎn)量增加, 因此, 直接抑制iNOS和NO的產(chǎn)生, 是炎癥治療的有效手段之一。我們的研究發(fā)現(xiàn), 阿魏酸能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細胞的NO的生成和iNOS蛋白的表達, 這可能是阿魏酸以通過抑制小膠質(zhì)細胞活化, 從而抑制神經(jīng)性炎癥的功能之一。

針對 AD等神經(jīng)退行性疾病的慢性炎癥理論,非甾體抗炎藥(non-steroidalant－inflammatory drugs,NSAIDs)被應(yīng)用于臨床測試, 其主要是通過 COX-1和COX-2途徑起作用的。COX-2是一些炎癥因子的誘導(dǎo)酶, 炎癥因子、LPS、促細胞分裂劑等分子以及損傷、低氧、局部缺血等試驗條件和多種神經(jīng)變性疾病, 均可誘導(dǎo)產(chǎn)生COX-2(Smith et al, 2000;Ho et al, 1999)。PGE2是COX-2途徑和免疫調(diào)節(jié)過程的代謝產(chǎn)物, 是急慢性炎癥疾病的一個重要的檢測指標。COX-2在AD患者海馬神經(jīng)元內(nèi)表達增加,尤其在AD早期COX-2的水平可作為病變的標志并最終影響AD的進展(Ho et al, 1999)。這些結(jié)果為早期用COX-2抑制劑治療AD提供了理論基礎(chǔ)。雖然長期服用NSAIDs可降低AD的患病風險, 但是長期應(yīng)用會導(dǎo)致嚴重的胃黏膜損傷和腎功能障礙等。因此, 安全性高、作用效應(yīng)好的新型藥物是有效治療AD的方向之一。IL-1β在神經(jīng)退行性疾病中具有重要作用, 一方面表現(xiàn)為 IL-1β能抑制神經(jīng)元鈣通道電流, 從而減少鈣過載發(fā)生而具有保護神經(jīng)細胞的功能(Zhou, 2010); 另一方面IL-1β不但可以激活星形膠質(zhì)細胞釋放炎癥因子, 還可以啟動“細胞因子循環(huán)”, 與其受體結(jié)合, 誘導(dǎo)相關(guān)的信號轉(zhuǎn)錄因子表達增加, 使得腦內(nèi)使得腦中長期慢性炎癥存在, 引發(fā)大量的神經(jīng)細胞的死亡(Sheng et al, 2001)。研究發(fā)現(xiàn), 阿魏酸是能夠顯著地抑制 COX-2蛋白以及致炎因子PGE2和IL-1β的表達。

TLRs是機體內(nèi)可識別并結(jié)合病原相關(guān)分子模式的重要受體之一, 通過啟動不同的信號途徑參與機體相關(guān)免疫調(diào)節(jié), 與AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病過程密切相關(guān)。在AD病人腦內(nèi), TLR呈現(xiàn)出的高表達狀態(tài), 例如, TLR2和TLR4(Walter et al, 2007)。TLR4屬于 TLR家族, 其配體主要為細菌產(chǎn)物, 易被LPS等病原體相關(guān)分子模式激活, 引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)。文獻報道, LPS作用人源小膠質(zhì)細胞, 激活TLR4, 從而導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin 6, IL-6)等炎癥因子的高表達(Chan et al, 2003; Becher et al,1996)。LPS與小膠質(zhì)細胞表面的 TLR4受體結(jié)合,導(dǎo)致受體發(fā)生二聚化, 激活p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, P38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)、核因子κB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB) 等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,最終誘導(dǎo) NO、COX-2、IL-1β等炎癥因子產(chǎn)生(Byrd-Leifer et al, 2000; Andrew & Ismar, 2005)。國內(nèi)外現(xiàn)有的關(guān)于阿魏酸抗炎作用的分子機制的研究主要集中在中下游 NF–κB/MAPK/JNK 激酶方面。我們著重研究阿魏酸對炎癥因子的影響以及與上游 TLR4介導(dǎo)相關(guān)的免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)系, 以期對阿魏酸抑制神經(jīng)性炎癥的作用機理有新的認識。在驗證阿魏酸能顯著抑制由 LPS誘導(dǎo)小鼠小膠質(zhì)細胞活化所產(chǎn)生的炎癥因子之后, 我們進一步探討阿魏酸的作用機制。實驗結(jié)果顯示, 經(jīng) LPS刺激BV-2小膠質(zhì)細胞后, 各藥物組的TLR4蛋白表達較正常組有明顯增加, 而各濃度的阿魏酸藥物組的TLR4蛋白表達量較LPS組下降, 表明阿魏酸神經(jīng)保護作用的機制可能是抑制 MAPK、NF-κB等信號通路的上游分子靶點 TLR4的表達, 從而減少下游產(chǎn)物NO、COX-2、IL-1β等炎癥因子表達。

本部分實驗證實, 阿魏酸具有抑制小膠質(zhì)細胞活化, 抑制神經(jīng)性炎癥的作用, 其機制可能是阿魏酸通過抑制TLR4相關(guān)的免疫信號通路達到抑制神經(jīng)性炎癥的效果。神經(jīng)退行性疾病是一個復(fù)雜多機制的參與過程, 阿魏酸的保護作用是否涉及到其他機制, 還有待繼續(xù)研究。

Andrew GB, Ismar RH. 2005. The role of Toll-like receptors in the host response to viruses [J].Mol Immunol, 42(8): 859-867.

Becher B, Fedorowicz V, Antel JP. 1996. Regulation of CD14 expression on human adult central nervous system-derived microglia [J].J NeurosciRes, 45(4): 375-381.

Byrd-Leifer CA, Block EF, Takeda K, Akira S, Ding A. 2000. The role of MyD88 and TLR4 in the LPS-mimetic activity of Taxo1 [J].Eur J Immunol, 31(8): 2448-2457.

Chan A, Seguin R, Magnus T, Papadimitriou C, Toyka KV, Antel JP, Gold R.2003. Phagocytosis of apoptotic inflammatory cells by microglia and its therapeutic implications: termination of CNS autoimmune inflammation and modulation by interferon-beta [J].Glia, 43(3):231-242.

Eitan O, Kathleen JG, Justin DL, Sung-Chun T, Mark PM, Thiruma VA.2009. Toll-like receptors in neurodegeneration [J].Brain Res Rev,59(2): 278-292.

Jin Y, Yan EZ, Li XM, Fan Y, Zhao YJ, Liu Z, Liu WZ. 2008.Neuroprotective effect of sodium ferulate and signal transduction mechanisms in the aged rat hippocampus [J].Acta Pharmacol Sin,29(12): 1399-1408.

Kim HS, Cho JY, Kim DH, Yan JJ, Lee HK, Suh HW, Song DK. 2004.Inhibitory effects of long-term administration of ferulic acid on microglial activation induced by intracerebroventricular injection of β amyloid peptide (1 - 42) in mice [J].Biol Pharm Bull, 27(1): 120-121.

Ho L, Pieroni C, Winger D, Purohit DP, Aisen PS, Pasinetti GM. 1999.Regional distribution of cyclooxygenase-2 in the hippocampal formation in Alzheimer’s disease [J].J Neurosci Res, 57(3): 295-303.

Sheng JG, Jones RA, Zhou XQ, McGinness JM, Van Eldik LJ, Mrak RE,Griffin WS. 2001. Interkeukin-1 promotion of MAPK-p38 over expression in experimental animals and in Alzheimer's disease：potential significance for tau protein phosphorylation [J].Neurochem Int, 39(5-6): 341-348.

Smith WL, DeWitt DL, Garavito RM. 2000. Cyclooxygenases: structural,cellular, and molecular biology [J].Annu Rev Biochem, 69: 145-182.

Rothwell NJ, Luheshi GN. 2000. Interleukin 1 in the brain: biology,pathology and therapeutic target [J].Trends Neurosci, 23(12): 618-625.

Walter S, Letiembre M, Liu Y, Heine H, Penke B, Hao W, Bode B, Manietta N, Walter J, Schulz-Schuffer W, Fassbender K. 2007. Role of the toll-like receptor 4 in neuroinflammation in Alzheimer's disease [J].Cell Physiol Biochem, 20(6): 947-956.

Zhou C. 2010. Inhibition effect of IL-1β on calcium channels currents in cultured cortical neurons of rat [J].Zool Res, 31(1): 89-93. [周辰. 2010.白介素 1β對培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元鈣通道電流的抑制作用. 動物學研究, 31(1): 89-93.]

Inhibitory effect of ferulic acid on in fl ammatory response in microglia induced by lipopolysaccharides

HUANG Feng1,*, DENG Hua-Ming1, ZHU Miao-Miao1, XIAO Fei2, YANG Li3,ZHANG Zai-Jun4, XIAO Ying4, NIE Hong1

(1.Department of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine,College of Pharmacy,Jinan University,Guangzhou510632,China; 2.Department of Pharmacology,School of Medicine,Jinan University,Guangzhou510632,China; 3.Department of Traditional Chinese Medicine,College of Pharmacy,Jinan University,Guangzhou510632,China; 4.Institute of New Drug Research,College of Pharmacy,Jinan University,Guangzhou510632,China)

Ferulic acid (FA) is a natural compound that expresses antioxidant and anti-inflammatory activities.Microglial cells are innate immune cells that reside within the central nervous system (CNS). Activated microglia mediated neuronal immunity contributes to the neurodegeneration associated with Alzheimer's disease. In this study, we investigated the inhibitory effect of FA on neuroinflammation in BV-2 microglial cells induced by lipopolysaccharides(LPS). Our study showed that FA significantly suppressed the production of nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2),interleukin-1β (IL-1β), and decreased induced type II nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2)protein in LPS-stimulated BV-2 microglia cells in a dose dependent manner. We hypothesized that this was achieved by suppressing the protein level of Toll-like receptor 4 (TLR4).

Ferulic acid; Lipopolysaccharides; Microglia; Neuroinflammation; Alzheimer's disease

R965; R282.71; R749.16

A

0254-5853-(2011)03-0311-06

10.3724/SP.J.1141.2011.03311

2011-03-07；接受日期：2011-04-19

廣東省醫(yī)學科研基金項目(A2010344); 暨南大學藥學院211工程和重點實驗室創(chuàng)新研究項目?

Corresponding author)，E-mail: hftxyy@yahoo.com.cn