孫曉霞，趙占民，劉道亮，張峻峰

(河北出入境檢驗檢疫局，河北石家莊，050051)

應用流式細胞技術快速定量檢測UHT奶產品中的微生物*

孫曉霞，趙占民，劉道亮，張峻峰

(河北出入境檢驗檢疫局，河北石家莊，050051)

采 用基于單個活細胞的新型熒光標記技術，精確區(qū)分UHT奶樣品中的活菌細胞與死細胞以及其他大顆粒物質，并應用流式細胞技術(flow cytometry，F(xiàn)CM)對UHT奶產品進行微生物快速定量檢測。通過與傳統(tǒng)的平板計數檢測方法進行比對，結果表明，F(xiàn)CM方法的檢測范圍為101～107CFU/mL，遠遠高于平板計數法。2種方法的計數結果相關性分析表明，在一定菌液濃度范圍內，F(xiàn)CM方法的定量結果與平板計數法線性相關良好，且對不同類型菌種都能精確標記定量，是更為快速、準確的檢測方法。

流 式細胞術，UHT奶，微生物，定量檢測

流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀70年代起源于細胞生物學領域的一門新興技術，目前已廣泛應用于臨床醫(yī)學診斷和基礎醫(yī)學研究等領域［1－2］，但是在食品安全監(jiān)測方面尚在起步階段。

流式細胞術的熒光染劑一般分為膜滲透性、膜非滲透性和膜電位敏感性等3種，對活菌和死菌、大顆粒物質難以進行標記區(qū)分［3］。本實驗采用新型標記技術，以市售UHT奶為實驗材料，模擬產品在生產、流通環(huán)節(jié)中受到微生物污染的情況下，利用流式細胞技術進行快速檢驗，并將實驗結果與傳統(tǒng)平板檢驗方法進行了比對。同時在檢測產品中人為添加了細菌、酵母菌以及霉菌的模式或代表菌株，證明通過采用流式細胞術的2個核心技術:熒光標記及流式細胞儀檢測平臺［4］，能夠對檢測材料中的活菌進行精確定量。

1 材料與方法

1.1 UHT奶產品

為了對比不同品牌的UHT奶成分是否會對實驗結果造成影響，研究中選購了當地市面上較常見、銷量較大的6種品牌產品進行實驗。

表1 本研究中所用UHT奶產品

1.2 試驗菌株

研究中所采用的大腸桿菌為細菌的模式菌株，同時也是食品受到污染后最常存在的腸道致病菌，它與金黃色葡萄球菌分別代表了常見食品致病菌中的革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌?？莶菅挎邨U菌代表了乳產品中常見的芽孢桿菌。釀酒酵母作為酵母菌的模式菌株，也是食品中廣泛存在的。黑曲霉是存在于環(huán)境和食品原料中的常見霉菌代表菌株。具體見表2所示。

表2 本研究中所用菌株

1.3 儀器設備

流式細胞分析儀(BactiFlow ALS系統(tǒng)，法國AES)，離心機(Sigma3K15，德國Sigma)，生化培養(yǎng)箱(LRH-150B，中國廣東)，渦旋混合器(MS1，德國IKA)，超純水儀(KL-UP-UN-10，中國臺灣艾柯)。濁度計(ZDY-Ⅱ，上海復星佰珞)。

1.4 培養(yǎng)基和試劑

FCM基礎試劑:

(1)ChemSol S 50X(code:300-R3106-01)，鞘液，用于分析過程中清洗或做保護液。

(2)Dilunt R(code:400-R6008-01)和CSR(code:300-R4095-01)，用于減少游離熒光。

(3)Isored(code:300-R3709-01)，隔離空氣中的氧氣。

(4)Cleaning5(code:300-R3107-02)清洗液，在分析過程中清洗進樣口。

(5)Cleaning3(code:300-R3064-01)清洗液，用于每天試驗結束后清洗系統(tǒng)。

FCM檢測試劑:

(1)Standard G(code:300-R5095-01)，細菌標準液(標準熒光珠子)，日?？刂圃噭?。

(2)Standard A(code:300-R5068-01)，霉菌與酵母菌標準液(標準熒光珠子)，日常控制試劑。

(3)ChemSol B26/1(code:400-R2702-02)，標記緩沖液。

(4)ChemChrome V26(code:400-R1006-01)，細菌標記底物。

(5)CS26 A(code:400-R4105-01)，標記細菌時減少背景熒光(含內標物)。

CS26 B(code:400-R4106-01)，用于優(yōu)化標記過程。在使用前和CS26 A混合，混合液僅限于當天使用。

(6)CSV(code:400-R4102-01)，標記霉菌與酵母菌時減少背景熒光，含內標物。

(7)CS13(code:400-R4108-01)減少非特異性標記。

(8)ChemChrome V8(code:400-R1002-01)，霉菌與酵母菌標記底物。

以上試劑均購自法國的AES公司。

培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯，平板計數瓊脂，孟加拉紅培養(yǎng)基，PDA液體培養(yǎng)基。均購自北京陸橋公司。

1.5 熒光標記

常用的FCM熒光染料通常存在著不能進入完整細胞膜或不能區(qū)分標記活細胞和死細胞，消除背景干擾等問題。本研究中采用ChemChrome V26熒光標底物標記細菌，ChemChrome V8熒光標記底物標記霉菌和酵母菌。樣品分裝到試管中上機后，儀器自動抽取并分裝底物進行標記。底物中均含有非熒光的二聚體底物，只有具膜完整性的活菌細胞中才存在的酯酶才能將非熒光二聚體底物中的酯鍵切斷，形成單聚體與活細胞結合而發(fā)出綠色熒光，這樣就避免了樣品內死菌細胞和其它大顆粒物質的干擾。標記后的樣品懸液被包裹在鞘液中經過噴嘴高速噴出，形成一條狹窄的分析流，確保細胞逐個通過激光聚焦的測量區(qū)，進而由光敏元件測量每個細胞或顆粒產生的熒光信號強度，從而獲得各種信號參數，并由數字處理器進行分析，對樣品中的活菌進行精確定量［5］。整個標記過程由儀器自動完成。

1.6 試驗方法

1.6.1 不同產品的熒光背景檢測

為了確定不同產品成分組成是否在用FCM方法檢測時會產生不同的熒光背景，并消除其對本研究中定量結果的干擾，首先對不同樣品進行熒光背景檢測。在無菌條件下打開產品包裝，用滅菌移液管吸取10 mL樣品于無菌試管中，每種樣品取4個平行，做好熒光標記后立即放入樣品槽中，開始程序，儀器會以機械手臂操控進樣探頭，自動依次從各待測試管中吸取1 mL樣品上機檢測。

1.6.2 自然增菌快速檢測

為了模擬UHT奶產品在生產、流通、貨架等真實環(huán)境中受到微生物污染的情況，本研究中將所購奶產品在無菌條件下開封取樣，先利用FCM進行快速檢測，同時以傳統(tǒng)的平板計數法作為對照，以確定樣品是無菌的。將樣品在無菌環(huán)境中打開包裝，然后暴露于自然空氣中放置24 h。這時樣品已受到環(huán)境中微生物污染并大量繁殖。為了保證檢測的模擬真實性，以增菌后的樣品為母液，以未開封的同類無菌樣品為稀釋液進行10倍數的梯度稀釋，共做8個梯度，并立即上機檢測。同時每個梯度各取1 mL于無菌平皿中，傾注高壓滅菌后冷卻到45℃的計數培養(yǎng)基，混勻凝固后于37℃下培養(yǎng)48h計數，各做3個平行［6］。

1.6.3 人為添加標準菌株的確證試驗

將表2中所列菌種分別活化并在各自適宜的培養(yǎng)基上轉接培養(yǎng)2代后，挑取細菌單菌落接種于滅菌后的10 mL營養(yǎng)肉湯管中于37℃培養(yǎng)24 h，制成菌懸液，經濁度計測定菌液濃度為1×109～5×109CFU/mL;挑取霉菌和酵母菌接種于滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基中于25℃培養(yǎng)48h，制成菌懸液，經濁度計測定菌液濃度分別約為3×108CFU/mL和6×107CFU/mL。以無菌操作，各取1 mL上述菌懸液，分別添加到9 mL無菌的UHT奶樣品中，振蕩混勻作為待檢樣品，并依次做10倍比梯度稀釋，共做8個梯度，將其放置于流式細胞分析儀樣品槽內上機檢測，同時用滅菌移液器吸取每稀釋度樣品于無菌平皿中，分別傾注計數瓊脂培養(yǎng)基(細菌)和孟加拉紅培養(yǎng)基(酵母菌和霉菌)作計數培養(yǎng)，各做3個平行［7］。

1.6.4 結果分析

將FCM方法的檢測結果與平板計數方法結果進行比對，并進行相關性分析。

2 結果與討論

2.1 背景測定

研究中采用的6種品牌的UHT奶樣品無菌開封后經FCM法檢測結果如下所示。

表3 FCM法測定不同品牌樣品背景

從表3可以看出，各品牌樣品的檢測值均小于1 CFU/mL，證明通過新方法標記，均未產生太大的熒光背景，即本方法可以很好地排除樣品中大顆粒物質的干擾。各樣品的平均值方差為0.035 42，小于0.05，即各樣品檢測結果之間差異不顯著，可以選擇一種產品繼續(xù)后面的實驗內容。本研究中選擇了伊利UHT奶作為后面的實驗材料。

2.2 自然增菌檢測

實驗結果如表4所示。從2種檢驗方法的定量結果中可以看出，在樣品菌液濃度從104～107CFU/mL，應用FCM方法可以對樣品進行精確定量，且各重復之間重現(xiàn)性很好;而平板計數法則因為超出了計數范圍而無法定量。在樣品菌液濃度從101～103CFU/mL，2種檢測方法均可以進行定量檢測，且各自重復之間的重現(xiàn)性很好。說明FCM方法采用激光讀取熒光值，數字處理系統(tǒng)自動計數，不受人工讀數能力的限制，在檢測限上大大優(yōu)越于傳統(tǒng)的平板計數法;且不受樣品背景干擾，可以將未處理的成品樣本直接上機檢測，大大簡化了微生物檢驗步驟。

表4 自然增菌檢測

圖1 自然增菌實驗FCM計數法與平板計數法相關性分析

以FCM檢測方法與平板計數方法的定量結果平均值為對象進行相關性分析，結果如圖1所示。2種檢測方法的定量結果呈線性相關，相關系數為0.999 8，說明兩者結果高度符合?；貧w斜率為0.961 3，說明FCM方法的定量結果要略高于平板計數結果。該現(xiàn)象的原因是因為平板計數方法要依靠人工讀數，可能會因人為因素而影響結果，而流式細胞儀的自動檢測平臺計數精確度要高于人工讀數。并且樣品中的受損微生物細胞可能會因為恢復較慢而不能在限定的培養(yǎng)時間內生長形成單一菌落，從而影響計數結果;而基于熒光標記計數的FCM檢測方法則不存在這個問題［8－9］。

2.3 人為添加標準菌株驗證實驗

在本部分實驗中，樣品中添加的各種標準菌株用FCM法均能精確計數，計數范圍從101到107CFU/mL，且梯度性很好(見表5)。而平板計數法的計數范圍只能從101到103CFU/mL。說明在本研究中采用的FCM檢測方法可以對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌都進行熒光標記和準確計數。將每種菌株的兩種檢測方法都在計數范圍內的計數結果進行相關性分析，結果如圖2所示。

檢測大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的兩種方法結果相關系數均為1，說明2種方法檢測細菌的計數結果高度相關。釀酒酵母和黑曲霉菌2種方法檢測結果的相關系數均在0.99以上，說明2種方法對酵母菌和真菌的檢測結果也高度相關。從而驗證了FCM法對UHT奶樣品中各種微生物進行 定量檢測的結果準確性［10－11］。

表5 人為增菌計數結果

圖2 人為添加標準菌株實驗2種定量方法結果的相關性分析

3 結論

在食品衛(wèi)生監(jiān)管過程中，檢驗人員在幾分鐘或幾個小時內向產品管理者提供微生物的分析結果，能夠對生產、運輸和庫存環(huán)節(jié)的微生物污染進行及時有效的控制而產生巨大效益，同時也大大降低了食品安全事故的發(fā)生率。目前，微生物檢測方法根據生物發(fā)光原理已經發(fā)展到能在幾分鐘得到結果［12］，但由于分析所需敏感性的限制并不能提供計數，因此應用于衛(wèi)生監(jiān)測存在著局限性。

本研究采用非熒光底物對單個可見活細胞進行特殊標記，每個細胞將被流式細胞儀系統(tǒng)的超敏感信號放大器檢測和計數。在這個系統(tǒng)中，熒光信號將被實時監(jiān)測，并通過尖端軟件進行分析以區(qū)分被標記的活細胞和其它非微生物的大顆粒物質以及死細胞。利用FCM進行樣品分析是完全自動化的，每小時能提供40～50個處理結果，效率遠遠高于傳統(tǒng)的平板計數法檢測［13］。而且省去了前處理和后繼培養(yǎng)步驟，比傳統(tǒng)的平板計數法檢測周期縮短了24～120 h［14］。并且通過與平板計數法的比對實驗，驗證了FCM檢測方法的準確性。

FCM檢測技術具有2大特點:計數和分選。本試驗中僅是對FCM技術應用于UHT奶產品的微生物安全定量監(jiān)測方面進行了初步研究。在進一步研究中可利用FCM分選技術實現(xiàn)對同一樣品里的不同微生物或細胞進行定性和分選提取。該技術在食品安全監(jiān)管方面有著廣大的應用前景。

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Quantitatively Detect Microorganism in UHT Milk Rapidly by Using Flow Cytometry

Sun Xiao-xia，Zhao Zhan-min，Liu Dao-liang，Zhang Jun-feng
(Hebei Entry-Exit Inspection and Quanrantine Bureau，Shijiazhuang 050051，China)

In this research we distinguish the live cells，dead cells and other large particles accurately in the UHT milk samples using a new Fluorescence Labeling Technique basing on single live cell，and quickly detect microorganism quantitatively by using flow cytometry.Comparison with traditional plate counting method shows that the detection range of FCM is 101～107CFU/mL，far above that of plate counting method.Correlation analysis of the results of the two methods shows that within certain concentration range of bacteria solution，the results of FCM and plate counting method are linear，and FCM is a more accurate and rapid detection method for different types of microorganism.

flow cytometry，UHT milk，microorganism，quantitatively detect

碩士，工程師。

*國家質檢總局科技計劃項目(No.2009IK174)

2010－04－16，改回日期:2010－12－10