陳海桂，顧楠，劉美艷，趙國華，2

1(西南大學食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市農產品加工技術重點實驗室，重慶，400715)

柑橘皮渣生物轉化燃料乙醇的研究進展*

陳海桂1，顧楠1，劉美艷1，趙國華1，2

1(西南大學食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市農產品加工技術重點實驗室，重慶，400715)

利 用柑橘皮渣生物轉化燃料乙醇是一種生產乙醇的安全可再生的方法。以柑橘皮渣為原料，通過酶或酸進行水解成可發(fā)酵糖液，利用糖酵解途徑發(fā)酵乙醇的微生物將其轉化為乙醇，提取脫水到99.5%濃度即得到燃料乙醇。這旨在解決柑橘產業(yè)大量副產物皮渣造成的環(huán)境污染資源浪費，同時生產乙醇作為枯竭的石油能源替代品。柑橘皮渣轉化乙醇中，D-檸檬烯嚴重抑制微生物發(fā)酵，但合理控制各種影響因素可達到較高的乙醇產量。文中對柑橘皮渣生物轉化燃料乙醇的過程及影響因素等進行了綜述。

柑 橘皮渣，生物轉化，燃料乙醇

近幾年，乙醇作為替代石油的新能源前景堪好，生產方式有化學合成和生物轉化2種。化學合成即乙烯水合法，因乙烯價格上漲使用減少。生物轉化是以農產品、農林廢棄物為原料，經水解轉化成微生物可利用的糖發(fā)酵乙醇，因原料可再生、經濟效益高而被廣泛采用。生物乙醇是使用最廣泛的生物燃料，多數(shù)歐洲國家的生物燃料乙醇占燃料替代品的15%，目前全球乙醇年產量達到了510億L［1］，乙醇作為新能源是未來發(fā)展趨勢。我國生物轉化燃料乙醇使用的原料約80%來自于谷物，燃料乙醇生產量大幅度提高，原料供應不足將彰顯突出，非糧原料如農林廢棄物等才可為乙醇生產提供保障。

2008年我國柑橘產量達到2 331萬t。柑橘在鮮食或者加工中產生的柑橘皮渣占果實的40%～60%，高達1 000多萬t，發(fā)酵沼氣和制取乙醇最好的原料［2］。本文在論述生物轉化燃料乙醇原理的基礎上，詳細介紹了生物轉化的過程及影響因素，以期為柑橘皮渣的利用和燃料乙醇的生產提供參考。

1 生物轉化燃料乙醇的原理

微生物利用糖發(fā)酵產生乙醇，其可在自身酶系統(tǒng)作用下，通過糖酵解途徑將可發(fā)酵糖轉化成乙醇和二氧化碳。如酵母菌在無氧條件下，將葡萄糖和果糖轉化為丙酮酸后降解，通過脫羧作用生成乙醛，乙醛還原得到乙醇。

酵母菌乙醇發(fā)酵可分為前發(fā)酵期、主發(fā)酵期和后發(fā)酵期。在前發(fā)酵期，接種酵母后，酵母自身進行生長繁殖;主發(fā)酵期，糖液中的可發(fā)酵糖快速分解，乙醇大量形成，發(fā)酵時間一般在24 h，發(fā)酵時間延長到48～72 h后，乙醇含量增加幅度小，乙醇產量已基本固定;后發(fā)酵期，酵母和固形物下沉，反應逐漸停止。

圖1 柑橘皮渣生物轉化燃料乙醇發(fā)酵過程

2 生物轉化燃料乙醇的發(fā)酵過程

柑橘皮渣生物轉化燃料乙醇的過程如下圖1所示。預處理后用酸或酶水解并進行發(fā)酵作用，可以分步進行或者同時糖化發(fā)酵轉化為乙醇。一般采用同時糖化發(fā)酵作用，即水解與微生物發(fā)酵在同一容器內同時進行。

2.1 柑橘皮渣預處理

2.1.1 柑橘皮渣蒸汽爆破

柑橘皮渣中D-檸檬烯的含量為8～16 mL/kg，進行蒸汽爆破主要作用在于去除D-檸檬烯，因其對釀酒酵母等微生物的發(fā)酵產生抑制作用。檸檬烯蒸汽壓超過100℃，使用蒸汽爆破去除效果較好。處理時采取130～170℃，通過不斷加熱加壓達到預定溫度后釋放壓力，皮渣細胞壁在壓力驟減時破裂，外果皮中的D-檸檬烯被蒸汽帶出，皮渣中D-檸檬烯含量下降到0.1%以下，對微生物發(fā)酵抑制作用減弱。Widmer等［3］研究發(fā)現(xiàn)較高溫度和較長處理時間，去除D-檸檬烯含量較多。在160℃蒸汽爆破處理4 min，D-檸檬烯含量下降到0.08%。預處理后進行酶水解48 h，水解液中糖含量從未預處理時的76%增長到94%。

同時，蒸汽爆破預處理能夠使水解酶進入細胞纖維素壁，增大酸或酶與柑橘皮渣的接觸面積，使糖化作用更完全，因而對柑橘皮渣蒸汽預處理能顯著降低對酶水解的要求［4］。但有實驗表明爆破可能會引起纖維素降解、部分纖維素解聚以及木質纖維素改性［5］，導致糖液量下降。

2.1.2 柑橘皮渣水解處理

柑橘皮渣主要成分碳水化合物多聚糖，經過酸或酶水解后成分是葡萄糖、半乳糖醛酸、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等，其中葡萄糖、果糖、蔗糖等約占80%，以上糖均可被微生物利用發(fā)酵乙醇。

酸水解時，用蒸餾水稀釋蒸汽爆破后的柑橘皮渣，使固形物含量在15%左右。一定溫度下用稀H2SO4水解，控制在10 min以內，水解后使用CaCO3調節(jié)pH。通過酸水解可精確測定纖維素和半纖維轉化為糖的量［6］。Grohmann 等［7］研究發(fā)現(xiàn)過濾柑橘皮渣酸水解液可去除部分D-檸檬烯順利進行發(fā)酵。Pourbafrani等［8］實驗得出最優(yōu)條件是在150℃下用稀H2SO4水解6 min，糖產量達到0.41 g/g柑橘皮渣干重。

柑橘皮渣酶水解時，常使用果膠酶、纖維素酶和半乳糖醛酸酶混合進行處理。使用果膠酶處理柑橘皮渣能夠得到高濃度的糖液，而纖維素酶只對不可溶物有分解作用。果膠酶和纖維素酶結合使用是水解柑橘皮渣中碳水化合物多聚物的最有效方法［9］。糖化作用在柑橘皮渣含量高達22%～23%時仍能進行，但得到的葡萄糖、果糖和蔗糖等可溶物含量降低，糖化作用速度下降2～3倍。非發(fā)酵糖和剩余的固體聚合物，干燥之后可以作為牛養(yǎng)飼料。Grohman等［10］研究發(fā)現(xiàn)熱H2SO4水解可溶性糖以及半纖維效果更好，同時酸水解明顯促進之后使用纖維素酶和果膠酶水解柑橘皮渣的效率。

2.2 發(fā)酵乙醇的菌種篩選

發(fā)酵乙醇的菌種要具增值能力大、乙醇耐受性強并且產率高、穩(wěn)定性好等特點。目前應用較多的有釀酒酵母、馴養(yǎng)的古巴Ⅱ號菌、克魯維酵母、多變發(fā)酵單胞菌以及基因重組后能產乙醇的大腸桿菌KO11等，其中多變發(fā)酵單胞菌與大腸桿菌KO11對D-檸檬烯最低抑制濃度一致，為0.05%(v/v)，但多變發(fā)酵單胞菌乙醇產量明顯要高?？唆斁S酵母是耐高溫菌，Widmer等［11］對其在37～45℃進行同時糖化發(fā)酵作用發(fā)現(xiàn)，克魯維酵母接種量大時性能較好，并且在42℃和45℃時也能產生乙醇，但乙醇量顯著下降到18%～38%。釀酒酵母在溫度高于37℃時性能不佳，但克魯維酵母能夠適應高溫發(fā)酵乙醇。非酵母菌運動發(fā)酵單胞菌比釀酒酵母和其他酵母乙醇產量更高，甚至產量可多達5倍［12］。

另外，Plessas等［13］使用一種商業(yè)釀酒酵母，使其固定在柑橘皮上用來發(fā)酵生產乙醇。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時間約5～15 h，比常規(guī)方法24 h要短，同時乙醇產量能達到1 506 g/L。Bai等［14］提出若使用固定酵母，固定酵母的費用，酵母細胞難以從固定體系中分離，以及增加了微生物污染的控制難度使固定酵母不能廣泛應用。

表1 主要發(fā)酵菌生物轉化乙醇的情況

3 影響柑橘皮渣生物轉化燃料乙醇的因素

3.1 D-檸檬烯

柑橘皮渣富含橘皮油，其主要成分為D-檸檬烯，對酵母的發(fā)酵具較強抑制作用，并且隨著發(fā)酵溫度和時間不同，最低抑制量也不同。David等［15］研究證實可通過加熱柑橘皮渣水解液除去D-檸檬烯，另一種方法是在酶水解后用離心法去除。Gerow［16］研究去除D-檸檬烯的最經濟的方案以及最優(yōu)化溫度為蒸汽爆破溫度在110～132℃。但柑橘皮渣中D-檸檬烯在細胞內以及皮渣的固形物中，所以去除的最適溫度應該稍高些。

Wilkins等［17］研究了橘皮油對多變發(fā)酵單胞菌發(fā)酵生產乙醇的影響。在30℃發(fā)酵24、48、72、96 h后橘皮油濃縮液抑制的最低限量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%;37℃ 發(fā)酵 24、48、72 h 后橘皮油濃縮液抑制的最低限量分別為0.05%、0.10%、0.20%，在96h后橘皮油對乙醇生產就不再有抑制作用。Wilkins等［18］研究發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯濃縮液初始濃度≥0.33%(v/v)，或24 h發(fā)酵后濃度≥0.14%時，發(fā)酵產生的乙醇量減少。Wilkins等［19］研究了橘皮油對啤酒酵母和克魯維酵母在37℃發(fā)酵柑橘皮渣的抑制作用，啤酒酵母比克魯維酵母對橘皮油耐受性好。

3.2 發(fā)酵底物濃度

柑橘皮渣生物轉化燃料乙醇過程中，糖液濃度對酵母菌的影響表現(xiàn)在對成熟醪液中乙醇產量以及酵母分解糖發(fā)酵的速度和利用率等方面。稀醪液可以提高酵母對糖分的利用率，更有利于生物轉化為乙醇。而濃醪液有利于減少乙醇提取濃縮時的蒸餾成本，但發(fā)酵底物濃度過高，抑制酵母發(fā)酵速度。另外，隨著發(fā)酵進行底物中積累的乙醇對高耐乙醇的菌株的抑制作用較小。因此在菌種選擇上，選擇能夠耐高糖濃度和耐高乙醇濃度的發(fā)酵菌更有利于生產乙醇。Zhao等［20］研究補充鋅顯著提高了絮凝酵母對乙醇的耐受性以及耐熱性，從而提高乙醇產量。

3.3 發(fā)酵條件

生物轉化燃料乙醇時，pH值、溫度、氧氣、營養(yǎng)物質等發(fā)酵條件對乙醇產量也有影響。一般在柑橘皮渣廢棄物初始pH值為4.8和pH值6.0時有較大的乙醇產量。保證培養(yǎng)基營養(yǎng)物質合適比例，既經濟又可以一定幅度提高釀酒酵母的乙醇產量。River等［21］提出用擬牛頓法(QN)和實數(shù)編碼遺傳法(RGA)估算乙醇產量和溫度之間的相關性以及最佳發(fā)酵溫度。Perego等［22］研究發(fā)現(xiàn)不同溫度、稀釋率和糖濃度不同對乙醇產量影響顯著。在添加酵母提取液、蛋白胨、混合氨基酸、玉米浸漬液等營養(yǎng)物質后菌種發(fā)酵乙醇的效率明顯提高。Karel等［23］利用大腸桿菌KO11發(fā)酵柑橘皮渣水解液生產乙醇時添加少量的氨基酸和肽，發(fā)酵動力明顯增加。

4 燃料乙醇的提取和質量指標

乙醇的提取通常是先將醪液分餾得到乙醇粗餾分，再通過精餾得到水體積＜0.5%的無水乙醇產品即為燃料乙醇。從柑橘皮渣發(fā)酵產物中提取乙醇可以通過單級分批蒸餾法，連續(xù)蒸餾難度較大［24］。目前較成熟的脫水方法是恒沸蒸餾和萃取蒸餾，但由于存在能耗高的缺點，逐漸發(fā)展出滲透汽化、吸附蒸餾、共沸蒸餾、加鹽萃取蒸餾、變壓吸附以及超臨界萃取等方法。

生物轉化中為了得到高質量的燃料乙醇，發(fā)酵醪液中要控制甲醇、甘油和雜醇油的產生外，要避免雜菌污染，蒸餾得到燃料乙醇時還需均衡進汽和進料以及控制溫度等。用紅外圖譜可鑒定乙醇的等級，醇的吸收峰C—O在1 049.265 cm－1為一級醇。

5 結論

燃料乙醇是一種可再生的替代逐漸石油資源的新能源。利用柑橘皮渣生物轉化燃料乙醇，不僅能解決其污染環(huán)境、浪費資源等問題，也為制備燃料乙醇提供了充足的原料。目前柑橘皮渣生物轉化燃料乙醇的應用還缺乏高新技術的支持，同時經濟成本較高，如廠房、設備、運輸和酶等的費用仍是一大問題，當前尤其需要誘變篩選得到高耐D-檸檬烯、耐高濃度糖液、乙醇量高產的菌株。乙醇脫水濃縮得到燃料乙醇過程中仍存在能耗高效率低或脫水技術難以工業(yè)化應用的問題，是限制皮渣生物轉化燃料乙醇產業(yè)規(guī)模發(fā)展的瓶頸，低成本高科技生物轉化燃料乙醇對于充分利用柑橘皮渣、緩解能源緊缺狀況至關重要。

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Progress on Fuel Ethanol Production from Citrus Peels by Biotransformation

Chen Hai-gui1，Gu Nan1，Liu Mei-yan1，Zhao Guo-hua1，2
1(College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China)2(Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Chongqing 400715，China)

Biotransformation of citrus peels for making fuel ethanol production is a safe renewable method.With citrus peels as materials by enzymes or acid hydrolysing into fermentable sugar，microorganisms by the glycolytic pathway ferment sugar into ethanol，and extract concentration of 99.5%dehydrated ethanol which are fuel ethanol.This is designed to address a large number of by-products of citrus industry that caused environmental pollution，while producing ethanol as the depletion of oil energy alternatives.D-limonene inhibits microbial fermentation when biotransformation of citrus peels，but the reasonable control of various factors will reach a high ethanol production.Citrus peels by biotransformation for making fuel ethanol and affecting factors were reviewed，which would provide valuable references for utilization of citrus peels and bio-ethanol production.

citrus peels，biotransformation，fuel ethanol

碩士研究生(趙國華教授為通訊作者，Email:zhaoguohua1971@163.com)。

*中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助(XDJK2009B003)

2010－07－27，改回日期:2010－11－17