吳煒亮，楊恒，朱文亮，周勇，熊娟，鄭建仙

1(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640)2(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東佛山，523800)

脂肪酶促酯交換改性脂質(zhì)的液-液萃取脫酸工藝

吳煒亮1，楊恒1，朱文亮2，周勇2，熊娟1，鄭建仙1

1(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640)2(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東佛山，523800)

研 究了脂肪酶促酯交換改性脂質(zhì)的液－液萃取脫酸工藝，通過單因素實驗和響應面法研究了萃取溶液濃度、物料比、萃取次數(shù)等工藝條件對改性脂質(zhì)脫酸率和得率的影響，確定了液－液萃取脫酸的工藝條件。結果表明:改性脂質(zhì)脫酸率隨萃取溶液濃度、物料比、萃取次數(shù)的增加而增加，而得率則隨這3個工藝條件的增加而減少。由響應曲面法得到的回歸模型能很好地反映各因素水平與改性脂質(zhì)脫酸率和得率之間的關系。兩因素對改性脂質(zhì)脫酸率的影響順序為萃取溶液濃度＞物料比，而兩因素對改性脂質(zhì)得率的影響順序則相反，物料比＞萃取溶液濃度。通過對改性脂質(zhì)脫酸率和得率的等高線進行疊加可得到液－液萃取脫酸的最佳工藝條件為乙醇水溶液濃度85.00%，物料比為1∶1。

液 －液萃取，乙醇，改性脂質(zhì)，游離脂肪酸，響應曲面

由于從油料中提取的毛油含有一定量的游離脂肪酸，影響油脂色澤、風味及其保質(zhì)期。脫除油脂中游離脂肪酸的過程稱之為脫酸［1－2］。油脂脫酸主要有化學法及物理法?；瘜W方法主要是堿煉法、液－液萃取法等，而物理方法主要包括物理蒸餾法、分子蒸餾法等［3－5］。堿煉法和蒸餾法是傳統(tǒng)的脫酸方法，工藝成熟且穩(wěn)定。然而，為保證脫酸效果，堿煉法用堿量較大，使大量中性油被皂化;物理蒸餾法的長時間高溫處理，使油脂品質(zhì)及保健營養(yǎng)價值降低［1］。新型脫酸法，如液－液萃取法、分子蒸餾，彌補了傳統(tǒng)脫酸方法的缺點，適用于處理酸值高、色澤深的毛油，如米糠油、小麥胚芽油。對脂肪進行改性需加入游離脂肪酸，在脂肪酶的催化作用下進行酯交換反應，過量的脂肪酸及酯交換生成的游離脂肪酸使改性脂質(zhì)的酸值增大。因此，此類改性脂質(zhì)不適于使用傳統(tǒng)脫酸方法精煉。

液－液萃取法的原理是根據(jù)游離脂肪酸和甘油三酯在萃取溶劑中的溶解性差別而將粗油脂中的脂肪酸脫除［3，6］。Apelblat等研究了 6 種有機溶劑，認為N－二甲基甲酰胺和1，2－丁二醇可用于大豆油及霍霍巴油的脫酸工藝［7］。Rodrigues等綜述了利用溶劑萃取法脫除菜油中游離脂肪酸的原理、可行性和優(yōu)點［6］;同時，他們利用米糠油混合體系建立數(shù)學模型，并利用模型預測兩種粗米糠油的萃取體系平衡［8］。Pina等研究了利用旋轉式萃取柱對玉米油進行連續(xù)式液－液萃取，研究因素對分散相停留時間和傳質(zhì)效率的影響［9］。因此，本研究中使用液－液萃取這一新型脫酸方法對脂肪酶促改性脂質(zhì)進行精煉，研究各因素對脫酸率及油脂得率的影響并使用響應曲面法優(yōu)化工藝條件將有助于改性脂質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設備

烏桕油，江蘇省東湖生物能源有限公司，酸值(AV)為4.28;Lipozyme TL IM，諾維信(中國)投資有限公司，催化活力250IUN/g，水含量5%質(zhì)量比;辛酸，上海九麟貿(mào)易有限公司，食品級;山崳酸，四川西普化工股份有限公司，C22∶0含量≥85%，分析純;3?分子篩，天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純;正己烷、95%乙醇，國藥集團化學試劑有限公司，分析純;無水乙醇，南京化學試劑有限公司，分析純;乙醚、酚酞，廣州化學試劑廠，分析純。

1052A型電熱鼓風恒溫干燥箱，中國通州市測量儀器儀表廠;101型電熱鼓風恒溫干燥箱，中國上海迅能電熱設備有限公司;DF101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，中國鞏義市予華儀器有限責任公司;RE52CS型旋轉蒸發(fā)儀，中國上海亞榮生化儀器廠;JA2103N型精密電子天平，中國常熟市雙杰儀器測試廠;BCD－268W型電冰箱，中國佛山市美的集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 改性脂質(zhì)的制備

稱取40.0 g 烏桕油(CTO)、12.0g辛酸、4.0 g 山崳酸于100 mL單口圓底燒瓶，于80℃烘箱中熔解，待完全熔解后，置于60℃水浴磁力攪拌器內(nèi)攪拌30 min，攪拌速度為100 r/min。待烏桕油與脂肪酸完全混合后，加入3.36 g Lipozyme TL IM固定化脂肪酶和3.2g 3?分子篩，攪拌反應12 h，攪拌速度為200 r/min。反應完成后，過濾得改性脂質(zhì);固定化酶經(jīng)正己烷洗滌2次后回收。

1.2.2 液－液萃取法脫酸

移取25.0 g熔化的改性脂質(zhì)于125 mL梨形分液漏斗，以1∶1的質(zhì)量比加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液，于35℃振蕩萃取5 min，靜置1h，待改性脂質(zhì)與乙醇溶液完全分層，下層為改性脂質(zhì)層，上層為萃取溶液層。將下層油脂層轉移至另一個潔凈的分液漏斗中，以上述相同的條件重復萃取8次。萃取后得到的油層移至100 mL圓底燒瓶中，使用旋轉蒸發(fā)儀將殘留于油層的乙醇脫除，得到脫酸后的改性脂質(zhì)，置于冰箱中保存，用于酸值及脂肪酸組成的檢測。

1.2.3 改性脂質(zhì)酸值的測定

改性脂質(zhì)酸值的測定根據(jù)《GB/T 5530－2005 ISO660－1996動植物油脂酸值和酸度測定》所使用的方法進行測定。制備得到的改性脂質(zhì)酸值為68.41。油脂的酸值可根據(jù)公式(1)計算得出。

AV:油脂的酸值，mgKOH/g;c:滴定使用的KOH的摩爾濃度，mol/L;V:滴定油脂的KOH使用量，mL;m:油脂樣品量，g。

1.2.4 響應曲面實驗

通過單因素實驗可知，對液－液萃取改性脂質(zhì)工藝影響最顯著的2個因素為萃取溶劑乙醇水溶液濃度及萃取溶劑與改性脂質(zhì)的物料比。因此，以乙醇水溶液濃度和物料比為自變量，而其它萃取條件固定不變，溫度為35℃，萃取次數(shù)為8次。利用中心旋轉組合設計對游離脂肪酸脫除率及改性脂質(zhì)得率進行優(yōu)化。實驗因素水平與編碼見表1，共13個實驗點，其中包括5個中心點重復試驗。通過最小二乘法擬合建立二次多項式回歸模型。

表1 中心旋轉組合設計的因素水平設計表

改性脂質(zhì)的游離脂肪酸脫除率可根據(jù)公式(2)計算得出，改性脂質(zhì)得率可由公式(3)得到。

AV0:液－液萃取脫酸前的改性脂質(zhì)酸值，mgKOH/g;AV1:液－液萃取脫酸后的改性脂質(zhì)酸值，mgKOH/g。

m0:改性脂質(zhì)在油相中的質(zhì)量，g;m1:改性脂質(zhì)在乙醇相中的質(zhì)量，g。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇水溶液濃度對改性脂質(zhì)脫酸工藝的影響

液－液萃取的關鍵在于萃取溶液與改性脂質(zhì)形成相分離，這取決于改性脂質(zhì)的游離脂肪酸含量及乙醇水溶液的濃度［10］。乙醇水溶液濃度過低，其脫酸效果不理想，而乙醇水溶液濃度過高，則與改性脂質(zhì)不能形成相分離。因此，乙醇水溶液濃度是改性脂質(zhì)脫酸工藝的一個重要參數(shù)。由實驗可知，在使用體積分數(shù)90%以上的乙醇水溶液進行液－液萃取脫除改性脂質(zhì)游離脂肪酸的過程中，兩相不能形成相分離，主要原因是改性脂質(zhì)的游離脂肪酸含量較高，而90%以上的乙醇水溶液其疏水性逐漸增強，當兩者混合進行液－液萃取脫酸后，形成均相溶液［10］。因此，選擇90%以下的乙醇水溶液，在物料比為1∶1，萃取8次的條件下考察其對改性脂質(zhì)脫酸工藝的影響。如圖1所示，隨著乙醇水溶液濃度的增加，改性脂質(zhì)脫酸率迅速增加。當乙醇水溶液濃度增加至85%以上時，脫酸率不顯著增加。相反，改性脂質(zhì)得率隨乙醇水溶液濃度的增加而逐漸減少，當使用90%乙醇水溶液為萃取液時，改性脂質(zhì)得率在90%以下。結合改性脂質(zhì)脫酸率及得率考慮，宜選取85%乙醇水溶液對改性脂質(zhì)進行脫酸工藝研究。

2.1.2 液－液萃取次數(shù)對改性脂質(zhì)脫酸工藝的影響

由于需進行脫酸的改性脂質(zhì)其酸值較高，需反復進行多次的液－液萃取方能將改性脂質(zhì)中的游離脂肪酸基本脫除，而萃取次數(shù)的多少對改性脂質(zhì)得率有較顯著的影響。隨著液－液萃取次數(shù)的增加，存在于改性脂質(zhì)中的游離脂肪酸含量減少，因此在萃取過程中進入乙醇水溶液相的脂肪酸含量減少，如圖2所示，使用85%乙醇水溶液，以物料比1∶1進行8次萃取的改性脂質(zhì)脫酸率可達到97.72%，酸值由68.41減少至1.56，若繼續(xù)增加萃取次數(shù)，脫酸率僅小幅增加。然而，改性脂質(zhì)得率隨萃取次數(shù)的增加而減少，因為每次萃取過程中都有少量的中性油脂進入乙醇水溶液層，因此增加萃取次數(shù)使得終產(chǎn)物質(zhì)量減少。從圖2可知，選擇萃取8次，既可獲得理想的脫酸率，又可以獲得較高的終產(chǎn)物得率。Tükay等在研究使用80%乙醇水溶液脫除油脂游離脂肪酸則得出萃取5 次的脫酸效果最佳，其物料比為 4∶1［11］。

圖1 乙醇水溶液濃度對改性脂質(zhì)脫酸工藝的影響

圖2 萃取次數(shù)對改性脂質(zhì)脫酸工藝的影響

2.1.3 物料比對改性脂質(zhì)脫酸工藝的影響

以體積分數(shù)85%乙醇水溶液及進行8次萃取為條件，研究乙醇溶液與改性脂質(zhì)質(zhì)量比對脫酸工藝的影響。由圖3可知，物料比越大，即乙醇水溶液的用量越大，改性脂質(zhì)脫酸率越高，而得率越小。由此可知，乙醇水溶液用量越大，在每次的萃取過程中可脫除更多的游離脂肪酸，與此同時，更多的中性油脂進入乙醇水溶液層而損耗，令終產(chǎn)物減少［12］。此外，Sun Ki Kim的研究也得出了相似的結論［13］。因此，在不損失過多的改性脂質(zhì)的情況下獲得高脫酸率可通過2種途徑達到，一是提高物料比而適當減少液－液萃取的次數(shù)，二是減小物料比而適當增加液－液萃取的次數(shù)。本實驗選擇后者，即乙醇溶液與改性脂質(zhì)質(zhì)量比為1∶1，8次萃取進行后續(xù)研究。

圖3 萃取物料體積比對改性脂質(zhì)脫酸工藝的影響

2.1.4 萃取溶液疏水性對改性脂質(zhì)脫酸工藝的影響

本實驗采用于體積分數(shù)85%乙醇水溶液中添加0%～8%正己烷以改變萃取溶液的疏水性。隨著正己烷的添加量增加，乙醇水溶液的疏水性增加。表2所示的是使用添加了0%～8%正己烷的85%的乙醇水溶液進行8次液－液萃取的脫酸率及脂質(zhì)得率的結果，利用單因素方差分析對這些結果進行顯著性分析。由表3可知，脫酸率和改性脂質(zhì)得率的組間偏差均具有顯著性(P＜0.05)，表明萃取溶液的疏水性顯著影響改性脂質(zhì)的脫酸工藝。結果與Tükay的研究結果相反［12］，可能是由于本實驗使用的改性脂質(zhì)的游離脂肪酸以未完全反應的辛酸為主，并伴有較少量的長碳鏈脂肪酸(山崳酸，酯交換出來的硬脂酸及棕櫚酸)。相對地，辛酸的烷基碳鏈較短，酸值較高，疏水性較弱;長碳鏈脂肪酸則酸值較低，疏水性較強。當加入正己烷后，乙醇水溶液的疏水性增強，進入溶劑相的辛酸相對減少，而長碳鏈脂肪酸則相應增加。因此，不含正己烷的萃取液相對于含有正己烷的萃取液而言能獲得較高的脫酸率。再者，中性甘油三酯也具有較強的疏水性，在萃取過程中其容易進入含有正己烷的萃取液層而使改性脂質(zhì)的得率減少。所以，乙醇水溶液中無需添加正己烷以改變其疏水性。

2.1.5 萃取溫度對改性脂質(zhì)脫酸工藝的影響

從工藝操作來講，溫度升高，溶劑比可以降低，而選擇性下降。改性脂質(zhì)的脫酸率及得率見表4。由表5的方差分析結果可知，萃取溫度對改性脂質(zhì)的脫酸率無顯著影響(P＞0.05)，但對改性脂質(zhì)的得率則有顯著影響，在35℃時進行8次萃取獲得的改性脂質(zhì)得率顯著高于其他溫度獲得的得率(P＜0.05)。因為在較高溫度下進行萃取，分層時更多的中性油脂傾向于進入乙醇水溶液層，從而使得改性脂質(zhì)的得率減少。

表2 萃取溶液疏水性對改性脂質(zhì)脫酸工藝的影響

表3 單因素方差分析結果

表4 萃取溫度對液-液萃取脫酸工藝的影響

表5 單因素方差分析的對比系數(shù)及對比結果表

2.2 中心旋轉組合設計優(yōu)化乙醇水溶液脫酸工藝

2.2.1 模型的構建

按照中心旋轉組合設計的統(tǒng)計學要求，對13組試驗的結果進行回歸擬合，試驗設計及響應值的實測值見表6。

表6 中心旋轉組合設計的試驗設計及試驗結果

運用Design Expert 8.0.2程序對13個試驗點的響應值進行回歸分析，建立響應曲面回歸模型，分別得到回歸方程:

Y1= －164.955 32+4.586 29A+55.013 08B －0.438 00A ×B －0.019 900A2－4.430 00B2

Y2=353.890 57 － 6.267 17A+12.566 42B －0.452 00A × B+0.040 755A2+5.505 00B2

由表7可知，2個回歸方程的復相關系數(shù)平方均大于0.80，表明各因子與脫酸率及改性脂質(zhì)得率之間的線性關系均較好。

表7 模型可信度分析的統(tǒng)計檢驗結果

2.2.2 方差分析

由表8的方差分析結果可知，得到的脫酸率回歸模型顯著(P＜0.05)，且失擬項不顯著，證明此模型較為理想。從2個因素(A、B)對脫酸率的影響來看，模型的一次項均對脫酸率有顯著的影響，且A＞B，模型的交互相AB及二次項A2、B2對脫酸率的影響均不顯著。

表8 脫酸率回歸模型的方差分析

由表9的方差分析結果可知，改性脂質(zhì)得率的回歸模型顯著(P＜0.05)，且失擬檢驗不顯著，證明模型較為理想。得率模型的一次項(A、B)均對得率有顯著的影響，且B＞A，交互項AB對脫酸率的影響不顯著，而二次項中僅B2對得率有顯著的影響。

表9 改性脂質(zhì)得率回歸模型的方差分析

2.2.3 響應曲面和等高線分析

由圖4(A)可知，油脂脫酸率隨乙醇水溶液濃度的增加而增加，隨物料比的增大而增大。由圖5(A)可知，改性脂質(zhì)得率則隨乙醇水溶液濃度和物料比的增加而減少。由圖4(B)可知，乙醇水溶液濃度小于80.00%時，等高線之間距離較密集，而大于80.00%時，等高線之間的距離則較疏松，由此可得到在恒定物料比，在乙醇水溶液濃度小于80.00%時改變其濃度，脂質(zhì)脫酸率的變化較大。由圖5(B)可知，物料比＜1.5時，等高線間間距較密集，而 ＞1.5時，等高線間距則較稀疏，說明使用相同的乙醇水溶液濃度脫除改性脂質(zhì)的游離脂肪酸，物料比＜1.5時，脂質(zhì)的得率變化比較大。

圖4 乙醇水溶液脫酸率的響應曲面圖及等高線圖

圖5 改性脂質(zhì)得率的響應曲面圖及等高線圖

2.2.4 驗證實驗

從上述分析中可以看出，脫酸率與油脂得率呈現(xiàn)一定程度的反比關系，即得到高脫酸率的同時必然會損失更多的油脂，反之亦然。因此，需要尋找一種解決方案保證有高脂質(zhì)得率的同時，盡可能地去除脂質(zhì)中的游離脂肪酸。將脫酸率及改性脂質(zhì)得率的等高線相疊加可以得到解決上述問題的條件。如圖6所示，圖中區(qū)域1、2所對應的乙醇水溶液濃度及物料比均可以保證得到高脂質(zhì)得率且脂質(zhì)中僅含有少量的游離脂肪酸。最佳的實施方案是乙醇水溶液濃度85.00%，物料比1∶1，在此條件下軟件的預測值為:脫酸率94.45%，改性脂質(zhì)得率95.29%。在此條件下進行2次平行實驗驗證最佳實施方案的可靠性，兩次實驗的脫酸率均值為96.47%，改性脂質(zhì)得率均值為94.56%。預測值與實驗值之間相差不大，說明得到的實施方案是最佳工藝條件。

圖6 脫酸率及改性脂質(zhì)得率等高線的疊加圖

3 結論

(1)通過單因素實驗研究液－液萃取脫酸工藝得出，乙醇水溶液體積濃度、物料比［m(乙醇水溶液)∶m(改性脂質(zhì))］、液－液萃取次數(shù)、萃取溶液的疏水性等因素均對改性脂質(zhì)脫酸率及得率有顯著影響。萃取溫度則對改性脂質(zhì)得率有顯著影響，對脫酸率的影響不顯著。通過單因素實驗可將液－液萃取次數(shù)設置為8次，萃取溫度為35℃，萃取溶液無需添加正己烷以提高其疏水性。

(2)在單因素實驗的基礎上，通過中心旋轉響應面設計得到以乙醇水溶液濃度及物料比為自量變，以對改性脂質(zhì)脫酸率及得率為因變量的兩個二次回歸模型。從通過分析回歸模型的響應面及等高線，可得到液－液萃取的最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)85.00%，物料比 1∶1。

(3)論文只探討了乙醇水溶液對改性脂質(zhì)脫酸效果的影響，而甲醇、異丙醇等醇水溶液對改性脂質(zhì)的脫酸效果尚未詳細研究。此外，對乙醇的回收利用及脫除得到的游離脂肪酸的濃縮或富集也尚未研究。上述的研究工作均要在以后的實驗中進一步地進行探討。

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The Investigation of Liquid-liquid Extraction Process of Modified Lipid Prepared by Lipase Catalyzed Transesterification

Wu Wei－ling1，Yang Heng1，Zhu Wen－liang2，Zhou Yong2，Xiong Juan1，Zheng Jian－xian1
1(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)2(Guangdong testing institute for product quality，Guangzhou，523800，China)

The liquid－liquid extraction process of modified lipid prepared by lipase catalyzed transesterification was investigated.The effects of extraction solution concentration，material ratio，extraction time on free fatty acid extraction ratio and modified lipid yield were investigated by single factor experiment and response surface methodology.The results show that free fatty acid extraction ratio is increasing with extraction solution concentration，material ratio，extraction time increasing，while yield is decreasing with these three process conditions increasing.The regression model from response surface methodology can highly reflect the relationship of different factor levels and free fatty acid extraction ratio，yield.The sequence of two factors influenced on free fatty acid extraction ratio of modified lipid is extraction solution concentration＞material ratio，while the sequence of two factors influenced on yield of modified lipid is reversed，material ratio＞extraction solution concentration.The optimal process is obtained by overlaying two contour lines of free fatty acid extraction ratio and modified lipid yield，and the optimal process is enthanol aqueous solution concentration 85.00%，material ratio 1∶1.

liquid－liquid extraction，enthanol，modified lipid，free fatty acid，response surface

博士研究生。

2010－06－10，改回日期:2010－12－07