胡靜榮

(華中科技大學生命科學與技術(shù)學院資源生物學與生物技術(shù)研究所，湖北武漢，430074)

二十碳五烯酸高產(chǎn)菌株的誘變選育及檸檬酸對其油脂合成的影響

胡靜榮

(華中科技大學生命科學與技術(shù)學院資源生物學與生物技術(shù)研究所，湖北武漢，430074)

利 用UV-LiCl復合誘變腐霉出發(fā)菌株，通過低溫培養(yǎng)和蘇丹Ⅱ染色鏡檢初篩、搖瓶發(fā)酵復篩，獲得1株二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)高產(chǎn)菌株腐霉H6，經(jīng)20℃ － 15℃二階段培養(yǎng)168 h，所得生物量、油脂含量和EPA含量分別為23.50 g/L、17.54%和15.36%，EPA產(chǎn)量為633.17 mg/L，較出發(fā)菌株(263.80 mg/L)提高了140.02%，且產(chǎn)量、性狀穩(wěn)定。添加不同濃度檸檬酸對腐霉H6油脂合成調(diào)控的研究表明，發(fā)酵中期添加1.5 g/L檸檬酸可顯著增加葡萄糖的利用率，提高油脂含量和EPA含量，EPA產(chǎn)量達890.49 mg/L，與對照相比提高40.64%。發(fā)酵實驗表明腐霉H6極有潛力開發(fā)成為工業(yè)化生產(chǎn)菌種。

二 十碳五烯酸，腐霉，復合誘變，檸檬酸，代謝調(diào)控

5，8，11，14，17-順式-二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-cis-Eicosapentaenoic acid，EPA)是一種 ω-3 系列多不飽和脂肪酸，是維持大腦、視網(wǎng)膜等正常功能和生長發(fā)育的必需脂肪酸。它具有重要的生理活性功能，可以降低血脂、預防動脈硬化等心血管疾?。?－2］，并具有抗癌［3］、抗炎［4］等作用。目前，生產(chǎn) EPA 的唯一商業(yè)來源是魚油，但深海魚油資源有限、成分復雜，并存在重金屬、農(nóng)藥殘留等問題［5］。而微生物發(fā)酵生產(chǎn)EPA具有脂肪酸組成簡單，合成周期短，不受環(huán)境、季節(jié)、氣候影響等優(yōu)點，成為近年來研究熱點。

作為生產(chǎn)EPA的替代來源，真菌、海洋細菌和微藻備受關注，主要包括畸雌腐霉(Pythium irregulare)［6］、腐敗希瓦式菌(又稱腐敗交替單胞菌 Shewanella putrefaciens)［7］、硅藻(Diatom nitzschia)［5］、微小小 球 藻 (Chlorella minutissima)［8］、三 角 褐 指 藻(Phaeodactylum tricornutum)［9］等。日本 Shimizu 等利用高山被孢霉(Mortierella alpina)通過外源添加亞麻籽油12℃培養(yǎng)9 d，再經(jīng)過休止細胞處理7 d，EPA產(chǎn)量達1.88 g/L［10］，但由于發(fā)酵周期較長，EPA 含量較低等問題，仍未實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。腐霉(Pythium)是藻狀菌綱霜霉目的真菌，Gandhi和Weete于1991年發(fā)現(xiàn)某些腐霉屬真菌可以產(chǎn)生EPA［11］，且具有培養(yǎng)設備較簡單，產(chǎn)物分離純化容易等優(yōu)勢。本文以腐霉為出發(fā)菌株，進行UV-LiCl復合誘變篩選，并研究外源添加檸檬酸對EPA發(fā)酵的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

腐霉(Pythium):由華中科技大學生命科學院資源生物學與生物技術(shù)研究所篩選，4℃保藏于PDA斜面，每2 個月轉(zhuǎn)接1 次［12］。

誘變培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 80、酵母粉 6、MgSO40.05，pH 值5.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 100、酵母粉 5、NaNO33、KH2PO42、MgSO40.05，pH 5.0。121℃滅菌 20 min。

1.2 誘變選育

取保藏的斜面菌種，小心挑取適量菌絲，轉(zhuǎn)接于裝有80 mL PDA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中活化，20℃培養(yǎng)120 h后，加入50 mL含有數(shù)粒無菌玻璃珠的0.5%LiCl溶液振蕩處理0.5 h，經(jīng)3層無菌紗布過濾，制成孢子懸液，梯度稀釋至10－3，取0.2 mL涂平板，置于波長253.7 nm，功率30 W的紫外燈下，分別照射不同時間(0、60、120、180、240、300、360 s)后，于15℃黑暗培養(yǎng)，120 h后初篩挑取菌落較大的菌株，染色后鏡檢選擇含油率較高的菌株。再進行液體搖瓶發(fā)酵復篩。

1.3 菌體培養(yǎng)

用0.9%NaCl溶液制成孢子懸液(方法同1.2)，取8 mL接種于裝有80 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，然后以接種量10%轉(zhuǎn)接于裝有80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，20℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)96 h后，培養(yǎng)箱程序降溫至15℃繼續(xù)培養(yǎng)至168 h后收集菌體。為考察檸檬酸對EPA發(fā)酵的影響，菌體培養(yǎng)至72 h，分別向發(fā)酵液中添加終濃度為 0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的檸檬酸，培養(yǎng)方法不變。每個樣品均有3個重復。

1.4 分析方法

油脂含量定性分析，利用蘇丹Ⅱ染色制片鏡檢，取PDA平板培養(yǎng)的菌絲少許，置于10 mL的小試管中，加入蘇丹Ⅱ染色液(0.5%蘇丹Ⅱ乙醇溶液)2 mL于20℃染色10 min，取出菌絲用蒸餾水洗滌2次，挑取菌絲制作臨時裝片，400倍顯微鏡下觀察。選取脂肪滴大且分布較多的菌株。

生物量測定，采用抽濾收集菌絲體，蒸餾水沖洗3次，置于80℃烘箱6～8 h干燥至恒重后稱量。油脂提取按照Bligh和Dyer總油脂快速提取法［13］，油脂于50℃氮氣環(huán)境下干燥后稱重，樣品甲酯化［14］后，采用浙江福立分析儀器廠9790氣相色譜儀進行脂肪酸甲酯組分分析，儀器配備交聯(lián)FFAP 35 m×0.25 mm石英毛細管柱以及FID檢測器。與脂肪酸甲酯標準品對照確定油脂成分，面積歸一化法進行定量分析。實驗數(shù)據(jù)由軟件Microsoft Excel處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 腐霉EPA高產(chǎn)菌株的誘變選育

采用LiCl與紫外線復合處理對腐霉進行誘變，共涂布84個平板，初篩挑取在相對低溫(15℃)生長較快的菌株，再通過蘇丹Ⅱ染色制片鏡檢，細胞內(nèi)的脂肪滴被染成紅色，見圖1，圖2。

圖1 腐霉出發(fā)菌株菌絲染色鏡檢(400倍)

選取脂肪滴較大分布較多的菌株作復篩。對初篩所得9個菌株進行復篩由圖3結(jié)果可以看出，其中8株菌的生物量、油脂含量均有提高，7株菌的EPA產(chǎn)量均高于出發(fā)菌株，編號為H6的菌株生物量、油脂含量和EPA含量分別達23.50 g/L、17.54%和15.36%，分別較出發(fā)菌株提高了14.54%、33.16%、55.18%。其EPA產(chǎn)量為633.17 mg/L，較出發(fā)菌株(263.80 mg/L)提高了140.02%。將菌株H6在PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)數(shù)次，搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明該菌株的產(chǎn)量性能基本穩(wěn)定。

圖2 腐霉H6菌絲染色鏡檢(400倍)

圖3 初篩所得9菌株液體搖瓶復篩生物量、油脂含量和EPA產(chǎn)量與出發(fā)菌株比較

LiCl是一種堿金屬鹵化物，其本身幾乎無誘變作用，但Li+可以限制RNA水解酶的活性，減慢轉(zhuǎn)錄，與一些誘變因子具有協(xié)同作用［15］。采用LiCl對孢子前處理，有利于突變的發(fā)生。誘變篩選實驗結(jié)果表明，UV-LiCl復合誘變是篩選腐霉EPA高產(chǎn)菌株的有效方法。較低溫度下，不飽和脂肪酸的含量增加從而增強細胞膜的流動性，是微生物對冷環(huán)境適應的結(jié)果［16］。但隨著溫度的降低，微生物生長受到抑制。因此，通過誘變選育在相對低溫(15℃)生長快速的菌株，既能提高菌體中油脂的不飽和度、又不影響發(fā)酵周期。蘇丹Ⅱ染色鏡檢觀察作為一種半定量法，操作簡便，可以得到含油率較高的菌株。搖瓶復篩結(jié)果表明該初篩方法具有較高的篩選效率。

2.2 外源檸檬酸對油脂合成的影響

為進一步提高菌體的油脂含量及EPA產(chǎn)量，進行了腐霉發(fā)酵調(diào)控研究。發(fā)酵至72 h分別添加0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L 檸檬酸結(jié)果表明(表 1)，添加適量檸檬酸有助于提高葡萄糖的利用率，增加菌體油脂積累和EPA的轉(zhuǎn)化。添加檸檬酸的最適添加濃度是1.5g/L，葡萄糖的利用率、油脂含量和菌體中EPA含量分別為73.81%、18.66%和3.62%(表1)，與對照相比分別增加了9.12%、6.39%和34.57%，油脂中EPA含量由15.36%(圖4)提高至19.42%(圖5)，EPA產(chǎn)量達890.49 mg/L，與對照相比提高了40.64%。

表1 不同檸檬酸含量對EPA搖瓶發(fā)酵的影響

檸檬酸是三羧酸循環(huán)的早期中間產(chǎn)物，檸檬酸含量較高時，反饋抑制丙酮酸激酶活性，并通過加強ATP的抑制效應來抑制磷酸果糖激酶的活力。由于丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶是EMP途徑的關鍵酶，所以發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量檸檬酸可以減弱EMP途徑代謝流量，從而增加HMP途徑代謝流量［17］，增加NADPH的產(chǎn)生，為合成脂肪酸提供還原力。同時，檸檬酸促進無活性的乙酰CoA羧化酶單體聚集成有活性的全酶，促進丙二酸單酰CoA的合成，從而加速脂肪酸的合成。根據(jù)腐霉生長規(guī)律，菌體培養(yǎng)至72 h進入穩(wěn)定期，此時菌體生長基本完成，向發(fā)酵液中添加檸檬酸，有利于油脂合成及EPA轉(zhuǎn)化。但添加檸檬酸超過1.5 g/L，生物量降低，不利于EPA產(chǎn)量的提高，推測由于檸檬酸濃度過高，抑制菌體生長所致。

圖4 腐霉H6基本培養(yǎng)基發(fā)酵所得脂肪酸甲酯GC分析

3 小結(jié)

出發(fā)菌株腐霉經(jīng)過UV-LiCl復合誘變，固體平板低溫培養(yǎng)、蘇丹Ⅱ染色鏡檢初篩，得到相對低溫下生長快速且含油率高的菌株，通過液體搖瓶發(fā)酵復篩，得到菌株腐霉H6，其EPA產(chǎn)量達633.17 mg/L，較出發(fā)菌株提高了140.02%。結(jié)果表明，此種篩選方法簡便、快速、有效。檸檬酸對腐霉油脂合成的調(diào)控研究結(jié)果表明，添加1.5g/L檸檬酸可以促進葡萄糖的消耗，增加油脂含量和 EPA含量，250 mL搖瓶中EPA產(chǎn)量可達890.49 mg/L。以后應進一步探討代謝調(diào)控的精準控制，并研究腐霉發(fā)酵的放大規(guī)律，逐步實現(xiàn)EPA發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化運用。

圖5 腐霉H6發(fā)酵中期添加1.5 g/L檸檬酸所得脂肪酸甲酯GC分析

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Mutation Breeding of High Yielding Strain of Eicosapentaenoic Acid and Effect of Citric Acid on the Lipid Synthesis

Hu Jing-rong
(Institute of Resource Biology and Biotechnology，College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China)

The original strain Pythium was mutated by UV combined with LiCl.After preliminary screening by low－temperature culturing and microscope observation after SudanⅡ staining，and re-screening by shake flask fermentation，a high－yielding eicosapentaenoic acid－producing strain Pythium H6 was obtained.Its biomass，oil and EPA content was 23.5 g/L，17.54%and 15.36%respectively after two stages of 15～20℃ culture for 168h.In addition，the EPA production of H6 was 633.17 mg/L，which was 140.01%higher than the original strain，and the product character was stable.The study of the lipid synthesis of Pythium H6 exposed to different concentrations of exogenous citric acid indicated that adding 1.5 g/L citric acid to fermentation medium can significant increase its glucose utilization，lipid and EPA content with EPA yield up to 890.49 mg/L，40.64%higher compared to the control.Fermentation experiments suggested that Pythium H6 has the potential to be developed into a highly industrial production strain.

Eicosapentaenoic acid，Pythium，composite mutation，citric acid，metabolic regulation

碩士研究生。

*國家自然基金項目(No.20776058)資助

2010－09－09，改回日期:2010－10－10