藍(lán)麗精， 周 琴， 蔡琪敏， 董夏夢， 汪鵬榮， 蔣冬花

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

能夠分解果膠質(zhì)的酶稱作果膠酶(pectinase)［1］．該酶可分為:原果膠酶、裂解酶(PL)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠酯酶(PE)［2］．相應(yīng)地，測量酶活性的方法也有很多，如滴定法、黏度下降法、脫膠作用時(shí)間法、還原糖測定法、紫外吸收測定法等．本實(shí)驗(yàn)酶活性測定均采用還原糖測定法中的 3，5-二硝基水楊酸(DNS)法［3］．

果膠酶主要應(yīng)用于食品加工業(yè)，在紡織、環(huán)境保護(hù)、飼料加工、生物制漿、木材防腐等行業(yè)中也有廣泛的應(yīng)用［4］．文獻(xiàn)［5］還研究了草酸青霉(Penicillium oxalicum)果膠酶的誘導(dǎo)抗病作用．

果膠酶主要由微生物和植物合成．微生物中的真菌、放線菌和細(xì)菌［6］都能產(chǎn)生果膠酶的相關(guān)酶系．目前國內(nèi)外研究與應(yīng)用較多的是細(xì)菌和霉菌，其中黑曲霉(Asperillus niger)是國際公認(rèn)的安全菌株，所以最受關(guān)注［7］．此外，酵母菌［8］、鏈霉菌和根霉［9］等也有相關(guān)的報(bào)道，而關(guān)于草酸青霉(Penicillium oxalicum)的相關(guān)報(bào)道甚少，草酸青霉(Penicillium oxalicum)產(chǎn)果膠酶的液體發(fā)酵更是鮮有報(bào)道．

果膠酶的傳統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)主要采用固體發(fā)酵法，但液體發(fā)酵法具有發(fā)酵條件參數(shù)易于測量、再現(xiàn)性強(qiáng)、易于控制等優(yōu)點(diǎn)．本實(shí)驗(yàn)從污泥中篩選到一株高產(chǎn)果膠酶的草酸青霉，運(yùn)用液體發(fā)酵法對(duì)其酶活性進(jìn)行了相關(guān)研究．

1 材料和方法

1．1 菌株來源

以從山東、四川、海南、浙江等地采集的土壤、昆蟲、動(dòng)物內(nèi)臟、腐爛水果等100多份樣品為材料，分離篩選獲得高產(chǎn)果膠酶菌株．

1．2 培養(yǎng)基

1)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 15 ～20 g，水 1 000 mL，pH 6．0．

2)產(chǎn)果膠酶篩選培養(yǎng)基:果膠30 g，NaNO33 g，K2HPO4·3H2O 3．3 g，KCl 0．5 g，F(xiàn)e2(SO4)30．01 g，(NH4)2SO420 g，MgSO40．24 g，CaCl20．15 g，KH2PO43．8 g，瓊脂粉20 g，溴酚藍(lán)0．2 g，水1 000 mL，pH 6．0．

3)搖瓶種子培養(yǎng)基:果膠4 g，(NH4)2SO41 g，KH2PO43．8 g，K2HPO4·3H2O 0．2 g，水 100 mL，pH 6．0．

4)搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基:桔皮粉4 g，米糠4 g，(NH4)2SO41 g，KH2PO43．8 g，K2HPO4·3H2O 0．2 g，水 100 mL，pH 6．0．

1．3 初篩

取適量土樣、昆蟲、腐爛果實(shí)等磨碎后加無菌水，于28℃培養(yǎng)24 h，然后取0．1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行涂布，培養(yǎng)3 d．產(chǎn)果膠酶的菌落著生的藍(lán)色培養(yǎng)基有黃色水解圈生成，挑取水解圈明顯的菌落進(jìn)行復(fù)篩［10］．

1．4 復(fù)篩

在篩選培養(yǎng)基中挑取水解圈大的單菌落，通過測定和計(jì)算其變色圈直徑和菌落生長圈直徑的比值(Dp/Dc)進(jìn)行復(fù)篩．在培養(yǎng)皿的中心分別接入初篩獲得的菌種，接種后培養(yǎng)皿置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d．測量各菌落生長圈的直徑Dc和變色圈的直徑Dp，選擇Dp/Dc值較大的菌種備用，最終選取一株果膠酶活性高的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．

1．5 搖瓶培養(yǎng)

將復(fù)篩獲得的菌種經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)后，用無菌水配成1．0×106的孢子懸浮液，取2 mL(搖瓶裝液量的5%)接入種子搖瓶培養(yǎng)基中，回轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，28℃培養(yǎng)24 h后，取3．2 mL(搖瓶裝液量的8%)種子液接入搖瓶培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)70 h．搖瓶裝液量均為250 mL三角瓶中裝40 mL．

1．6 粗酶液的提取

發(fā)酵液在4℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液．

1．7 酶活性測定

采用 3，5-二硝基水楊酸(DNS)法［3］測定酶活性．吸取0．2 mL適當(dāng)稀釋的酶液于試管中，加1．8 mL 0．4%的果膠底物溶液，50℃水浴反應(yīng)30 min后，加2 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10 min，冷卻后蒸餾水定容到15 mL，搖勻．空白對(duì)照:吸取0．2 mL煮沸的稀釋酶液于試管中，加2 mL DNS試劑和1．8 mL 0．4%的果膠底物溶液，50℃水浴反應(yīng)30 min，沸水浴10 min，冷卻后蒸餾水定容到15 mL，搖勻．在540 nm波長處測定吸光度．在上述反應(yīng)體系中，以每毫升果膠酶液降解果膠底物1 min產(chǎn)生1 μg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位．

1．8 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)果膠酶的影響

取3．2 mL(搖瓶裝液量的8%)種子液接入40個(gè)250 mL裝液量為40 mL的三角瓶內(nèi)，160 r/min，28℃搖瓶培養(yǎng)，每隔2 h取樣．接著，將菌體一并用濾紙過濾，然后用烘箱于50℃烘至恒重，再用分析天平稱菌絲體干質(zhì)量．實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次．

1．9 菌種鑒定

1．9．1 培養(yǎng)和形態(tài)特征觀察

將菌株在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3 d，用顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子梗、分生孢子等特征．

1．9．2 DNA提取與ITS序列分析

取PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3 d的新鮮菌絲體50 mg，加液氮研磨成粉末，用試劑盒提取DNA．利用真菌通用引物 ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進(jìn)行rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列擴(kuò)增，測序由上海生物工程有限公司完成．將測得的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，通過同源性分析對(duì)菌株進(jìn)行分子水平的鑒定．

2 結(jié)果

2．1 產(chǎn)果膠酶菌株的分離篩選

利用產(chǎn)果膠酶的菌株可以使加溴酚藍(lán)的培養(yǎng)基產(chǎn)生黃色水解圈的原理，本實(shí)驗(yàn)從土壤、腐爛水果等生境復(fù)篩得到黃色水解圈較大的7株霉菌(見圖1和圖2)，對(duì)其進(jìn)行Dp/Dc值及酶活性的測定，結(jié)果見表1．

圖1 篩選所獲部分菌落圖

圖2 L5菌株的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征

表1 7株產(chǎn)果膠酶菌株的Dp/Dc值和酶活性比較

由表1可以看出，菌株的酶活性隨著Dp/Dc值增大而增大，L5菌株的Dp/Dc值最高，相應(yīng)的酶活性為 39 940 U·min－1·mL－1．L5 菌株是從浙江東陽荷塘淤泥中篩選得到的．圖2(a)為L5菌株在溴酚藍(lán)篩選培養(yǎng)基上的黃色水解圈照片．

2．2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)L5菌株產(chǎn)果膠酶的影響

對(duì)每隔2 h取樣得菌體進(jìn)行干質(zhì)量測量，并繪制生長曲線見圖3．由圖3可知:將菌體從種子培養(yǎng)基中接入搖瓶培養(yǎng)基約需0～10 h的停滯期;接著10～24 h，菌絲生長，菌體質(zhì)量進(jìn)入對(duì)數(shù)期;其后曲線趨于平緩，24～68 h是菌體質(zhì)量的穩(wěn)定期;從68 h始，菌體開始自溶，進(jìn)入衰亡期．

每隔2 h測量一次L5菌株產(chǎn)生的果膠酶酶活性，以酶活性為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制曲線(見圖3)．由圖3可知:在2～70 h內(nèi)，L5菌株產(chǎn)果膠酶的活性逐漸上升，在菌體穩(wěn)定期結(jié)束時(shí)酶活性達(dá)到最大值39 940 U·min－1·mL－1;在76～80 h內(nèi)，果膠酶的活性下降．

圖3 L5菌株的生長曲線

2．3 L5菌株的分類鑒定

2．3．1 形態(tài)學(xué)鑒定

1)培養(yǎng)特征:PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d即形成較典型的菌落，菌落中間呈藍(lán)綠色，邊緣為白色，直徑約19 mm，輪廓規(guī)則，外觀呈絨毛狀．

2)形態(tài)特征:28℃ PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，顯微鏡下觀察L5菌株的菌絲形態(tài)、分生孢子梗的分枝情況、帚狀枝及瓶梗的類型等顯微形態(tài)特征．由圖2可見:菌絲細(xì)胞絲狀交織，具橫隔;分生孢子梗不具足細(xì)胞，帚狀枝為對(duì)稱雙輪型，瓶梗細(xì)長漸變尖銳;分生孢子橢圓形，呈藍(lán)綠色．

2．3．2 ITS的PCR擴(kuò)增與序列分析

用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)L5菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲一長度為572 bp的目的片段．將測序所得序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)進(jìn)行BLAST比對(duì)和同源性分析，結(jié)果表明L5菌株的ITS序列與Penicillium oxalicum同源性最高達(dá)99%．基于L5菌株的ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4，結(jié)合形態(tài)特征鑒定，將L5菌株鑒定為草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)［11］．

圖4 基于L5菌株的ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

果膠酶的研究應(yīng)用迄今已有70多年的歷史，其用途廣泛，現(xiàn)階段產(chǎn)量已是世界四大酶制劑之一，而中國現(xiàn)有的生產(chǎn)果膠酶工藝存在著很多問題，如固體發(fā)酵成本高、生產(chǎn)率低、易染菌等．面對(duì)國外果膠酶產(chǎn)品的優(yōu)勢，我國必須利用豐富的微生物資源，研究新的生產(chǎn)工藝，加緊篩選出擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、低成本、無污染、滿足市場需求的商業(yè)化果膠酶．

本研究從污泥中篩選得到一株高產(chǎn)果膠酶的菌株，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，并對(duì)其進(jìn)行了ITS測序，確定其為草酸青霉菌．該菌的ITS序列基因已登錄GenBank，登錄號(hào)為:HQ680452．

本研究利用浙江來源豐富的桔皮和米糠作為搖瓶培養(yǎng)基材料，研究表明:該菌株在28℃，培養(yǎng)基初始pH 6．0，轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下，培養(yǎng)70 h果膠酶活性最高，可達(dá) 39 940 U·min－1·mL－1;并且，該菌株利用成本低廉、天然、含果膠的植物材料為培養(yǎng)基，不僅實(shí)現(xiàn)了廢物再利用，也可以使其高產(chǎn)．可見，對(duì)該菌株的研究具有潛在的意義，其應(yīng)用前景廣闊．

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