石 瑞， 曹詣斌， 陳文榮， 郭衛(wèi)東

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

GRAS蛋白家族是高等植物所特有的具有高度保守羧基末端的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子家族，長度在400～700個氨基酸，1999年首次被命名，GRAS取于最早被發(fā)現(xiàn)的3個功能成員GAI，RGA與SCR［1］．目前，在煙草、大豆、蓖麻、擬南芥、楊樹等植物中都有發(fā)現(xiàn)．從擬南芥基因組中鑒定了33個GRAS家族基因，被分為7個分支，分別是DELLA蛋白分支、SCR分支、Ls分支、HAM分支、PAT1分支、SHR分支和SCL9分支［2］．它們在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素調(diào)節(jié)及分生組織的保持中起關(guān)鍵性作用［3］．GRAS 家族具有轉(zhuǎn)錄因子活性［1］，參與了植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和發(fā)育過程．已報道的GRAS家族基因包括控制植物根部徑向細(xì)胞分裂的SHR和SCR1、參與赤霉素激素信號途徑的GAI1和RGA1和參與光信號途徑的 PAT1和 SCL13［3-7］．Achard等［8］證明，擬南芥依賴CBF1的冷誘導(dǎo)信號途徑能夠通過影響赤霉素(GA)的代謝來調(diào)節(jié)抑制蛋白DELLA的積累，而DELLA蛋白通過有別于CBF誘導(dǎo)的低溫調(diào)節(jié)機(jī)制大大地促進(jìn)了CBF1誘導(dǎo)的冷馴化和抗凍性作用．DELLA蛋白在整合體內(nèi)信號和逆境信號進(jìn)而調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方面起著關(guān)鍵的作用［9］．

佛手(Citrus medica var．sarcodactylis Swingle)是浙江、廣東、廣西、四川、福建等地重要的特色經(jīng)濟(jì)樹種，在浙江以金華的“金佛手”最為著名，樹體矮小并適合作觀賞盆景［10］．但是，佛手抗寒性差，低溫對佛手的影響非常嚴(yán)重．因此，對佛手抗逆機(jī)理的研究及其抗逆新品種的培育顯得越來越緊迫．郭衛(wèi)東等［11］從佛手半致死溫度入手對其抗寒性生理生化指標(biāo)進(jìn)行了研究．佛手常規(guī)雜交育種的難度很大，因此需要挖掘其自身抗低溫逆境的基因，研究其分子作用機(jī)理，并通過操作這類基因的表達(dá)來實現(xiàn)佛手對不良環(huán)境的適應(yīng)．

筆者用抑制消減雜交方法從佛手中篩選得到了與低溫相關(guān)的一段表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)片段，結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到該基因的全長序列，對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，顯示該基因具有GRAS保守結(jié)構(gòu)域，并對該基因在不同時間低溫脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行了研究．

1 材料與方法

1．1 材料

選用的材料為長勢一致的兩年生浙江金華佛手品種“青皮”(C．medica cv．'Qingpi')的盆栽苗［10］．

1．2 處理

在人工氣候室進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，溫度設(shè)置參照劉祖祺等［12］的方法，預(yù)培養(yǎng)溫度為夜間20℃/白天28 ℃，光照每天14 h，光照強(qiáng)度為1 234．6 lx，濕度為75%，定期澆水．預(yù)培養(yǎng)3周后在2 d內(nèi)將溫度緩慢降至4℃進(jìn)行冷鍛煉7 d．在4℃下設(shè)置不同處理時間為0，12，24，36，48 h，0 h 為對照，取樣進(jìn)行分析，單株重復(fù)3次．

1．3 RNA的提取與第一鏈cDNA的合成

對來自佛手的10株植株的對照組與處理組(4℃培養(yǎng)12，24，36，48 h)的存儲葉片采用 Trizol方法進(jìn)行RNA提取，RNA第一鏈cDNA的合成使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶cDNA試劑盒(TAKARA)，其合成的cDNA作為GRAS基因克隆與實時熒光定量 PCR(real-time quantitative PCR，qRT-qPCR)的模板．

1．4 RACE方法對佛手GRAS基因的克隆

根據(jù)已獲得的佛手EST片段，與美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中與佛手EST同源性高的楊樹、蓖麻、擬南芥的GRAS基因序列進(jìn)行比對拼接，使用ClustalW2進(jìn)行多序列比對，并通過 Oligo6，Primer Premier等設(shè)計引物 5(見表1)．以佛手葉片組織的單鏈cDNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增．反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性;94℃，30 s;50℃，30 s;72 ℃，30 s．電泳檢測目的基因的存在．通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)對單鏈cDNA進(jìn)行5'加尾反應(yīng)，加尾后引入錨定引物QT進(jìn)行錨定PCR．為了防止非特異性條帶的產(chǎn)生，實驗采用多組巢式引物(nested primer，見表1)進(jìn)行多輪巢式擴(kuò)增，獲得GRAS基因的全長編碼區(qū)序列．將PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳割膠回收后連接到PMD18-T載體(TAKARA)，送往生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行序列測定．

1．5 同源性的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫中循環(huán)延遲分集(CDD)分析目的基因的保守結(jié)構(gòu)域;應(yīng)用ClustalW2，MEGA 4．1對目的基因與已知序列基因進(jìn)行多序列比對及進(jìn)化樹分析．

1．6 佛手GRAS基因在低溫脅迫下的表達(dá)

利用熒光定量PCR方法分析佛手GRAS基因在不同時間低溫脅迫下的表達(dá)．

4℃低溫條件下分別對佛手植株進(jìn)行0，12，24，36，48 h處理，以0 h為對照，提取佛手葉片的RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，佛手看家基因β-actin為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR分析．目的基因的引物為:GRAS 5':5'-ATGTCGCTCCACCCTCT-3';GRAS 3':5'-TACTGCCGCATTCCTCC-3'．內(nèi)參β-actin的引物為:β-actin 5':5'-TCATACGGTCGGCAATA-3'，β-actin 3':5'-AAAGCCAAGGCGGTGAA-3'．

表1 GRAS基因5'和3'RACE巢式PCR擴(kuò)增特異引物

使用ABI STEPONE熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR分析，采用20 μL反應(yīng)體系:SYBRTM Premix Ex Taq 10 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0．4 μL，ROX Reference Dye 50x 0．4 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 7．8 μL．反應(yīng)程序為:94 ℃ 預(yù)變性30 s;PCR反應(yīng):94℃ 5 s，50℃ 35 s，總共40個循環(huán)，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測．以β-actin作為內(nèi)參，將一個cDNA樣品經(jīng)系列稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品來構(gòu)建相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得待測樣品的相對表達(dá)量．

2 結(jié)果與分析

2．1 RNA的提取與第一鏈cDNA的合成

取實驗組和對照組的總RNA溶液5 μL，在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測RNA的質(zhì)量，結(jié)果見圖1．可以看到:實驗組和對照組的總RNA有3條帶，分別是28 S rRNA，18 S rRNA和5 S rRNA帶，并且28 S rRNA帶的亮度是18 S rRNA帶的2倍．實驗結(jié)果說明所提總RNA的完整性良好，沒有降解現(xiàn)象．利用看家基因actin作為內(nèi)參對合成的cDNA進(jìn)行PCR檢測．根據(jù)設(shè)計的actin引物，在53℃的退火溫度下可得到400 bp左右的PCR產(chǎn)物(見圖1)，說明cDNA制備成功．

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

2．2 序列分析

測序結(jié)果顯示:該cDNA包含1 669個堿基;序列比對和同源性分析表明該cDNA包含1 236 bp的開放閱讀框，編碼413個氨基酸(見圖2)．利用GenBank數(shù)據(jù)庫提供的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫對佛手EST基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，表明該基因?qū)儆贕RAS家族基因(見圖3)，具有保守的GRAS結(jié)構(gòu)域，因此命名為CmsGRAS(GenBank登錄號:JF440647)．

2．3 序列同源比對

Blastx分析該基因的氨基酸序列與擬南芥已發(fā)現(xiàn)的33個GRAS基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，采用MEGA 4．1軟件，以鄰近法(NJ)對佛手與擬南芥AtGRAS 1～33氨基酸序列繪制進(jìn)化樹，根據(jù)進(jìn)化樹的比對結(jié)果，顯示佛手GRAS基因與擬南芥AtSCL5，PAT1基因的氨基酸序列同源性較高，親緣關(guān)系較近(見圖4)．

圖2 佛手GRAS轉(zhuǎn)錄因子序列

圖3 佛手GRAS保守結(jié)構(gòu)域分析

2．4 GRAS基因低溫處理的定量PCR分析

定量PCR分析表明(見圖5):在4℃低溫處理后，GRAS基因的表達(dá)量隨處理時間的延長而逐漸升高，0 h時表達(dá)量最低，12 h時與對照差異不大，24 h時表達(dá)量較對照上升約7倍，36 h時表達(dá)量超過對照近10倍，達(dá)到最高．實驗結(jié)果表明該基因的表達(dá)受到低溫脅迫誘導(dǎo)，在36 h處理時間內(nèi)隨著低溫脅迫時間的增加，其表達(dá)量呈上升的趨勢，其表達(dá)量的增加可能與低溫脅迫應(yīng)答有關(guān)．

圖4 佛手和擬南芥的GRAS序列進(jìn)化樹

圖5 佛手在4℃寒冷脅迫下GRAS基因的熒光定量分析

3 討論

通過RACE方法從佛手中獲得一個GRAS基因，該基因具有GRAS蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，與擬南芥中發(fā)現(xiàn)的33個已知GRAS基因序列比對后，發(fā)現(xiàn)佛手的 GRAS氨基酸序列與擬南芥SCL5，PAT1基因同源性較高，因此推斷獲得的cDNA序列是佛手的GRAS基因．

采用低溫脅迫處理研究佛手GRAS基因在寒冷脅迫下的表達(dá)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)佛手植株在4℃處理后，在較短時間內(nèi)誘導(dǎo)了該基因的表達(dá)，并隨著脅迫時間的加長其表達(dá)量有逐漸上升的趨勢，說明該基因?qū)Φ蜏孛{迫能夠做出積極的反應(yīng)．

Bolle等［5］研究表明，PAT1 與 SCL1/5/13 為同源亞族，PAT1在擬南芥中可能參與光敏色素A信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑．文獻(xiàn)［13］將 SCL1/5/8/13/21和PAT1列為一個分支，稱為PAT1亞家族．郭華軍等［14］實驗證實 SCL5與 PAT1為一個分支，且SCL5能受到干旱和滲透脅迫誘導(dǎo)，并且其表達(dá)量在誘導(dǎo)處理時呈逐漸上升的趨勢，證實它與干旱滲透脅迫有關(guān)．而佛手在4℃處理36 h時GRAS的表達(dá)量增加近10倍，明顯高于對照，根據(jù)該基因?qū)Φ蜏靥幚砗筠D(zhuǎn)錄水平的反應(yīng)，推測它在佛手耐低溫上有一定的作用，可能參與佛手逆境適應(yīng)的調(diào)節(jié)．此結(jié)果為利用轉(zhuǎn)基因手段選育耐低溫的佛手新品種提供了理論依據(jù)．

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