宋 宇(綜述),段 勇,王玉明(審校)
(昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,昆明650032)
細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡,在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要作用。凋亡抑制會導(dǎo)致自身免疫性疾病或腫瘤,而凋亡亢進(jìn)與組織器官退行性病變有關(guān)。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程,涉及一系列凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),目前比較清楚的通路主要有外源性途徑和內(nèi)源性途徑。Bcl-2家族分子在內(nèi)源性(線粒體)途徑中起重要作用,其中p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(puma)是Bcl-2家族BH3-only亞家族成員,可被p53快速誘導(dǎo)并具有強(qiáng)大的促凋亡作用。
2001 年,Yu[1]和 Nakano 等[2]兩個獨(dú)立的研究小組分別從結(jié)直腸癌細(xì)胞系和人類成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中分離出新的可被p53快速誘導(dǎo)并具有強(qiáng)大促凋亡作用的p53靶基因,后被鑒定為同一基因,并命名為puma。人 puma 基因定位于 19q13.3~ q13.4,cDNA全長1.9 kb,富含GC序列。該基因具有4個外顯子(1a或1b、2、3、4)和3 個內(nèi)含子,其中外顯子 2 含假定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),外顯子3中含編碼BH3的序列。轉(zhuǎn)錄后形成四種不同的剪接體(puma-α、-β、-γ 和-δ)。其中只有 puma-α(相對分子質(zhì)量為 23×103)和puma-β(相對分子質(zhì)量為18×103)編碼的蛋白中含有促凋亡活性所必需的BH3功能結(jié)構(gòu)域。puma編碼產(chǎn)物為193個氨基酸的蛋白質(zhì),其中C端疏水序列和BH3結(jié)構(gòu)域分別是puma定位和促凋亡功能的基礎(chǔ)。puma直接或間接地與抗凋亡Bcl-2蛋白發(fā)生相互作用,解除Bcl-2/Bcl-xL對Bax/Bak的抑制作用,Bax/Bak構(gòu)象改變后在線粒體膜上形成寡聚物,使膜通透性增加、外膜電勢降低、釋放細(xì)胞色素C入胞質(zhì),啟動caspase級聯(lián)反應(yīng),最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。
迄今為止一共發(fā)現(xiàn)了8個BH3-only蛋白,它們在哺乳動物中廣泛存在,有學(xué)者提出特異性應(yīng)激刺激能協(xié)同個別BH3-only蛋白激活線粒體凋亡途徑的假說,puma作為BH3-only家族成員也得到了廣泛研究[3]。生理狀況下puma表達(dá)量較低,但在DNA損傷藥物、血清饑餓和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等刺激誘導(dǎo)下可顯著升高。研究表明[3],puma-/-細(xì)胞株對p53轉(zhuǎn)錄依賴的刺激(如γ射線)和p53轉(zhuǎn)錄非依賴的刺激(如細(xì)胞因子缺失、糖皮質(zhì)激素和佛波酯等)發(fā)生凋亡抵抗現(xiàn)象。近年來,puma在促凋亡過程中的作用得到了廣泛認(rèn)可,研究puma在凋亡相關(guān)疾病和細(xì)胞株中的表達(dá)、在化學(xué)物質(zhì)暴露下的表達(dá)改變成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
2.1 puma在細(xì)胞株中的表達(dá) Uo等[4]發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的鼠神經(jīng)細(xì)胞中,puma基因的表達(dá)與喜樹堿誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Niizuma等[5]通過夾閉大鼠雙側(cè)頸總動脈構(gòu)建短暫性腦缺血模型,發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)線粒體樣本的puma蛋白表達(dá)顯著上調(diào),免疫共沉淀顯示puma與Bax結(jié)合,表明puma在短暫性腦缺血后海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中發(fā)揮著重要作用。Kuroki等[6]采用線栓法制備鼠短暫性腦缺血/再灌注動物模型,在不同的時間點(diǎn)取出腦組織進(jìn)行mRNA定量分析和蛋白質(zhì)印跡分析,結(jié)果顯示栓塞側(cè)皮質(zhì)puma mRNA和PUMA蛋白明顯高于對側(cè),該實(shí)驗(yàn)為局灶性腦缺血引起B(yǎng)H3-only基因puma的轉(zhuǎn)錄和翻譯提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Ghosh等[7]分別對出生 7 d 的 puma-/-、Noxa-/-、Bim-/-、Hrk-/-和p53-/-幼鼠皮下注射乙醇以模擬宮內(nèi)乙醇暴露的影響。結(jié)果顯示,僅puma-/-幼鼠神經(jīng)細(xì)胞明顯抵抗凋亡,表明宮內(nèi)乙醇暴露通過p53非依賴、Bax和puma依賴的途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
人肝臟Huh-7細(xì)胞株在飽和脂肪酸刺激下發(fā)生脂性凋亡,puma mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào),RNAi干擾 puma后細(xì)胞凋亡被明顯抑制[8]。McKenzie等[9]將 Bim-/-、Noxa-/-、puma-/-、Bid-/-的胰島 β細(xì)胞分別暴露于高濃度葡萄糖,發(fā)現(xiàn)puma-/-明顯抵抗線粒體途徑凋亡,表明puma在葡萄糖毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡中起了關(guān)鍵作用。
Waster等[10]利用紫外燈管模擬紫外光源照射人黑素瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),紫外輻射導(dǎo)致黑素瘤細(xì)胞凋亡,puma mRNA表達(dá)量隨紫外光源照射暴露的時間呈時間依賴性。Karst等[11]研究了107例原發(fā)性黑素瘤、51例轉(zhuǎn)移性黑素瘤和64例結(jié)構(gòu)不良痣后發(fā)現(xiàn),puma表達(dá)與惡性程度呈顯著負(fù)相關(guān),是5年疾病特異生存率的獨(dú)立預(yù)測因子。
免疫細(xì)胞大量凋亡是導(dǎo)致膿毒癥高病死率的重要因素之一。抑制免疫細(xì)胞的凋亡成為了控制膿毒癥進(jìn)展的靶點(diǎn)。Brahmamdam等[12]構(gòu)建小鼠盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥模型,發(fā)現(xiàn)敗血癥脾臟CD4+T細(xì)胞中puma表達(dá)與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。siRNA沉默puma基因后,CD4+T細(xì)胞中PUMA蛋白顯著下降,同時免疫細(xì)胞存活率上升,表明puma在凋亡引起的CD4+T免疫細(xì)胞耗竭中起著重要作用。Inoue等[13]的研究也表明白細(xì)胞介素15通過增加抗凋亡Bcl-2、減少促凋亡基因Bim和PUMA蛋白表達(dá)來抑制免疫細(xì)胞凋亡。
Obexer等[14]利用 RNAi干擾 puma后發(fā)現(xiàn),糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的p16INK4A重組白血病細(xì)胞的凋亡被顯著抑制,表明puma表達(dá)在很大程度上介導(dǎo)抑癌基因p16INK4A誘導(dǎo)的凋亡敏感性。Iglesias-Serret等[15]發(fā)現(xiàn)puma在阿司匹林誘導(dǎo)的人白血病細(xì)胞株凋亡中發(fā)揮促凋亡作用。
Hoque等[16]對30例原發(fā)腫瘤標(biāo)本和10株頭頸部鱗癌細(xì)胞株的puma編碼區(qū)序列進(jìn)行檢測,結(jié)果表明無論p53處于何種突變狀態(tài),所有標(biāo)本中均未見puma突變。徐波等[17]發(fā)現(xiàn),糖皮質(zhì)激素在誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的白血病細(xì)胞凋亡過程中,不能引起puma表達(dá)的上調(diào)。
2.2 puma在人體組織中的表達(dá) 陳鑫等[18]利用半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測胃癌組織、癌旁組織中四種剪接體的mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)puma四種剪接體在胃癌組織中的表達(dá)下調(diào),與癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。Jansson等[19]應(yīng)用免疫組化和半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)研究散發(fā)的大腸癌,發(fā)現(xiàn)puma mRNA、蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)與正常黏膜相比,既有上調(diào)也有下調(diào),puma上調(diào)或下調(diào)與臨床病理特征及預(yù)后均無相關(guān)性,因此得出puma表達(dá)的改變在大腸癌的發(fā)展中發(fā)揮次要的作用。王玉明等[20]研究表明,puma mRNA和蛋白在非小細(xì)胞肺癌、癌旁和遠(yuǎn)癌肺組織和肺良性病變組織中差異無統(tǒng)計學(xué)意義,puma表達(dá)可能不是伴隨肺癌發(fā)生和侵襲發(fā)展過程的重要因素。puma在某些細(xì)胞株凋亡、腫瘤組織和自身免疫疾病等的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,但在某些組織或細(xì)胞中可能發(fā)揮次要作用或不發(fā)揮作用。
皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)河豚毒素處理3 d后,puma基因表達(dá)水平顯著升高并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。Zn2+使神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中的puma表達(dá)呈劑量和時間依賴效應(yīng)[22]。植物赫曲毒素A能上調(diào)人肝癌細(xì)胞puma表達(dá)[23]。組蛋白去乙酰酶抑制劑通過p53-puma-Bax途徑誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡[24]。抗腫瘤藥物Zolinza/vorinostat能顯著提高耐藥乳腺癌細(xì)胞移植的裸鼠對腫瘤壞死相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的凋亡敏感性[25]。Hung 等[26]發(fā)現(xiàn),puma 在一氧化氮誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞線粒體凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
Lam 等[27]發(fā)現(xiàn),MAP4K3 通過 mTORC1(哺乳動物雷帕霉素靶)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)PUMA蛋白表達(dá),進(jìn)一步激活Bax,最終促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞株的凋亡。Sun等[28]發(fā)現(xiàn),puma通過p73β和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號途徑介導(dǎo)上皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑誘導(dǎo)的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株凋亡,為了進(jìn)一步驗(yàn)證puma在該途徑中的作用,Sun等[28]應(yīng)用短發(fā)夾RNA干擾puma后發(fā)現(xiàn),鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株凋亡率顯著降低。絲/蘇氨酸蛋白激酶通過磷酸化降低TAp63蛋白的穩(wěn)定性來抑制TAp63誘導(dǎo)的肝腫瘤細(xì)胞凋亡[29],在p53變異的肝腫瘤細(xì)胞株中剔除絲/蘇氨酸蛋白激酶能反式激活puma,并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除此之外,細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子、缺氧誘導(dǎo)因子1α和FoxO3a也轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)puma基因[30-32]。
自2001年幾個實(shí)驗(yàn)室相繼報道了puma基因強(qiáng)大的促凋亡作用之后,對puma的研究逐漸成為熱點(diǎn),不少研究已經(jīng)證實(shí)了puma在介導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞株凋亡中的重要作用,但仍有許多問題亟待解決:①puma缺陷是否會有發(fā)生腫瘤的傾向。②體外實(shí)驗(yàn)表明誘導(dǎo)puma表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,但在體內(nèi)試驗(yàn)中的效果和安全性不能確定。③某些情況下p53和puma過表達(dá)細(xì)胞卻不發(fā)生凋亡的原因尚待探究。④puma還受到哪些因素和途徑調(diào)控,以及這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的聯(lián)系也待闡明。目前研究puma在組織和細(xì)胞株中的促凋亡作用以及化學(xué)藥物對puma的影響都是為今后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和腫瘤治療作準(zhǔn)備。相信隨著研究的逐漸深入,對惡性腫瘤和凋亡相關(guān)疾病的治療會有突破性進(jìn)展。
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