宋 宇(綜述)，段 勇，王玉明(審校)

(昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明650032)

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要作用。凋亡抑制會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病或腫瘤，而凋亡亢進(jìn)與組織器官退行性病變有關(guān)。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，涉及一系列凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，目前比較清楚的通路主要有外源性途徑和內(nèi)源性途徑。Bcl-2家族分子在內(nèi)源性(線粒體)途徑中起重要作用，其中p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(puma)是Bcl-2家族BH3-only亞家族成員，可被p53快速誘導(dǎo)并具有強(qiáng)大的促凋亡作用。

1 puma的結(jié)構(gòu)和功能

2001 年，Yu［1］和 Nakano 等［2］兩個(gè)獨(dú)立的研究小組分別從結(jié)直腸癌細(xì)胞系和人類成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中分離出新的可被p53快速誘導(dǎo)并具有強(qiáng)大促凋亡作用的p53靶基因，后被鑒定為同一基因，并命名為puma。人 puma 基因定位于 19q13.3～ q13.4，cDNA全長(zhǎng)1.9 kb，富含GC序列。該基因具有4個(gè)外顯子(1a或1b、2、3、4)和3 個(gè)內(nèi)含子，其中外顯子 2 含假定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，外顯子3中含編碼BH3的序列。轉(zhuǎn)錄后形成四種不同的剪接體(puma-α、-β、-γ 和-δ)。其中只有 puma-α(相對(duì)分子質(zhì)量為 23×103)和puma-β(相對(duì)分子質(zhì)量為18×103)編碼的蛋白中含有促凋亡活性所必需的BH3功能結(jié)構(gòu)域。puma編碼產(chǎn)物為193個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中C端疏水序列和BH3結(jié)構(gòu)域分別是puma定位和促凋亡功能的基礎(chǔ)。puma直接或間接地與抗凋亡Bcl-2蛋白發(fā)生相互作用，解除Bcl-2/Bcl-xL對(duì)Bax/Bak的抑制作用，Bax/Bak構(gòu)象改變后在線粒體膜上形成寡聚物，使膜通透性增加、外膜電勢(shì)降低、釋放細(xì)胞色素C入胞質(zhì)，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。

2 puma在細(xì)胞凋亡中的作用

迄今為止一共發(fā)現(xiàn)了8個(gè)BH3-only蛋白，它們?cè)诓溉閯?dòng)物中廣泛存在，有學(xué)者提出特異性應(yīng)激刺激能協(xié)同個(gè)別BH3-only蛋白激活線粒體凋亡途徑的假說(shuō)，puma作為BH3-only家族成員也得到了廣泛研究［3］。生理狀況下puma表達(dá)量較低，但在DNA損傷藥物、血清饑餓和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等刺激誘導(dǎo)下可顯著升高。研究表明［3］，puma-/-細(xì)胞株對(duì)p53轉(zhuǎn)錄依賴的刺激(如γ射線)和p53轉(zhuǎn)錄非依賴的刺激(如細(xì)胞因子缺失、糖皮質(zhì)激素和佛波酯等)發(fā)生凋亡抵抗現(xiàn)象。近年來(lái)，puma在促凋亡過(guò)程中的作用得到了廣泛認(rèn)可，研究puma在凋亡相關(guān)疾病和細(xì)胞株中的表達(dá)、在化學(xué)物質(zhì)暴露下的表達(dá)改變成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

2.1 puma在細(xì)胞株中的表達(dá) Uo等［4］發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的鼠神經(jīng)細(xì)胞中，puma基因的表達(dá)與喜樹(shù)堿誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Niizuma等［5］通過(guò)夾閉大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈構(gòu)建短暫性腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)線粒體樣本的puma蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，免疫共沉淀顯示puma與Bax結(jié)合，表明puma在短暫性腦缺血后海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中發(fā)揮著重要作用。Kuroki等［6］采用線栓法制備鼠短暫性腦缺血/再灌注動(dòng)物模型，在不同的時(shí)間點(diǎn)取出腦組織進(jìn)行mRNA定量分析和蛋白質(zhì)印跡分析，結(jié)果顯示栓塞側(cè)皮質(zhì)puma mRNA和PUMA蛋白明顯高于對(duì)側(cè)，該實(shí)驗(yàn)為局灶性腦缺血引起B(yǎng)H3-only基因puma的轉(zhuǎn)錄和翻譯提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Ghosh等［7］分別對(duì)出生 7 d 的 puma-/-、Noxa-/-、Bim-/-、Hrk-/-和p53-/-幼鼠皮下注射乙醇以模擬宮內(nèi)乙醇暴露的影響。結(jié)果顯示，僅puma-/-幼鼠神經(jīng)細(xì)胞明顯抵抗凋亡，表明宮內(nèi)乙醇暴露通過(guò)p53非依賴、Bax和puma依賴的途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

人肝臟Huh-7細(xì)胞株在飽和脂肪酸刺激下發(fā)生脂性凋亡，puma mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，RNAi干擾 puma后細(xì)胞凋亡被明顯抑制［8］。McKenzie等［9］將 Bim-/-、Noxa-/-、puma-/-、Bid-/-的胰島 β細(xì)胞分別暴露于高濃度葡萄糖，發(fā)現(xiàn)puma-/-明顯抵抗線粒體途徑凋亡，表明puma在葡萄糖毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡中起了關(guān)鍵作用。

Waster等［10］利用紫外燈管模擬紫外光源照射人黑素瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，紫外輻射導(dǎo)致黑素瘤細(xì)胞凋亡，puma mRNA表達(dá)量隨紫外光源照射暴露的時(shí)間呈時(shí)間依賴性。Karst等［11］研究了107例原發(fā)性黑素瘤、51例轉(zhuǎn)移性黑素瘤和64例結(jié)構(gòu)不良痣后發(fā)現(xiàn)，puma表達(dá)與惡性程度呈顯著負(fù)相關(guān)，是5年疾病特異生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

免疫細(xì)胞大量凋亡是導(dǎo)致膿毒癥高病死率的重要因素之一。抑制免疫細(xì)胞的凋亡成為了控制膿毒癥進(jìn)展的靶點(diǎn)。Brahmamdam等［12］構(gòu)建小鼠盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)敗血癥脾臟CD4+T細(xì)胞中puma表達(dá)與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。siRNA沉默puma基因后，CD4+T細(xì)胞中PUMA蛋白顯著下降，同時(shí)免疫細(xì)胞存活率上升，表明puma在凋亡引起的CD4+T免疫細(xì)胞耗竭中起著重要作用。Inoue等［13］的研究也表明白細(xì)胞介素15通過(guò)增加抗凋亡Bcl-2、減少促凋亡基因Bim和PUMA蛋白表達(dá)來(lái)抑制免疫細(xì)胞凋亡。

Obexer等［14］利用 RNAi干擾 puma后發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的p16INK4A重組白血病細(xì)胞的凋亡被顯著抑制，表明puma表達(dá)在很大程度上介導(dǎo)抑癌基因p16INK4A誘導(dǎo)的凋亡敏感性。Iglesias-Serret等［15］發(fā)現(xiàn)puma在阿司匹林誘導(dǎo)的人白血病細(xì)胞株凋亡中發(fā)揮促凋亡作用。

Hoque等［16］對(duì)30例原發(fā)腫瘤標(biāo)本和10株頭頸部鱗癌細(xì)胞株的puma編碼區(qū)序列進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明無(wú)論p53處于何種突變狀態(tài)，所有標(biāo)本中均未見(jiàn)puma突變。徐波等［17］發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素在誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的白血病細(xì)胞凋亡過(guò)程中，不能引起puma表達(dá)的上調(diào)。

2.2 puma在人體組織中的表達(dá) 陳鑫等［18］利用半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)胃癌組織、癌旁組織中四種剪接體的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)puma四種剪接體在胃癌組織中的表達(dá)下調(diào)，與癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。Jansson等［19］應(yīng)用免疫組化和半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)研究散發(fā)的大腸癌，發(fā)現(xiàn)puma mRNA、蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)與正常黏膜相比，既有上調(diào)也有下調(diào)，puma上調(diào)或下調(diào)與臨床病理特征及預(yù)后均無(wú)相關(guān)性，因此得出puma表達(dá)的改變?cè)诖竽c癌的發(fā)展中發(fā)揮次要的作用。王玉明等［20］研究表明，puma mRNA和蛋白在非小細(xì)胞肺癌、癌旁和遠(yuǎn)癌肺組織和肺良性病變組織中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，puma表達(dá)可能不是伴隨肺癌發(fā)生和侵襲發(fā)展過(guò)程的重要因素。puma在某些細(xì)胞株凋亡、腫瘤組織和自身免疫疾病等的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但在某些組織或細(xì)胞中可能發(fā)揮次要作用或不發(fā)揮作用。

3 化學(xué)藥物對(duì)puma表達(dá)的影響

皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)河豚毒素處理3 d后，puma基因表達(dá)水平顯著升高并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［21］。Zn2+使神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中的puma表達(dá)呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)［22］。植物赫曲毒素A能上調(diào)人肝癌細(xì)胞puma表達(dá)［23］。組蛋白去乙酰酶抑制劑通過(guò)p53-puma-Bax途徑誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡［24］。抗腫瘤藥物Zolinza/vorinostat能顯著提高耐藥乳腺癌細(xì)胞移植的裸鼠對(duì)腫瘤壞死相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的凋亡敏感性［25］。Hung 等［26］發(fā)現(xiàn)，puma 在一氧化氮誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞線粒體凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

4 其他轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)puma

Lam 等［27］發(fā)現(xiàn)，MAP4K3 通過(guò) mTORC1(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)PUMA蛋白表達(dá)，進(jìn)一步激活Bax，最終促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞株的凋亡。Sun等［28］發(fā)現(xiàn)，puma通過(guò)p73β和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)途徑介導(dǎo)上皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑誘導(dǎo)的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株凋亡，為了進(jìn)一步驗(yàn)證puma在該途徑中的作用，Sun等［28］應(yīng)用短發(fā)夾RNA干擾puma后發(fā)現(xiàn)，鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株凋亡率顯著降低。絲/蘇氨酸蛋白激酶通過(guò)磷酸化降低TAp63蛋白的穩(wěn)定性來(lái)抑制TAp63誘導(dǎo)的肝腫瘤細(xì)胞凋亡［29］，在p53變異的肝腫瘤細(xì)胞株中剔除絲/蘇氨酸蛋白激酶能反式激活puma，并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除此之外，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子、缺氧誘導(dǎo)因子1α和FoxO3a也轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)puma基因［30-32］。

5 問(wèn)題與展望

自2001年幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼報(bào)道了puma基因強(qiáng)大的促凋亡作用之后，對(duì)puma的研究逐漸成為熱點(diǎn)，不少研究已經(jīng)證實(shí)了puma在介導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞株凋亡中的重要作用，但仍有許多問(wèn)題亟待解決:①puma缺陷是否會(huì)有發(fā)生腫瘤的傾向。②體外實(shí)驗(yàn)表明誘導(dǎo)puma表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但在體內(nèi)試驗(yàn)中的效果和安全性不能確定。③某些情況下p53和puma過(guò)表達(dá)細(xì)胞卻不發(fā)生凋亡的原因尚待探究。④puma還受到哪些因素和途徑調(diào)控，以及這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的聯(lián)系也待闡明。目前研究puma在組織和細(xì)胞株中的促凋亡作用以及化學(xué)藥物對(duì)puma的影響都是為今后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和腫瘤治療作準(zhǔn)備。相信隨著研究的逐漸深入，對(duì)惡性腫瘤和凋亡相關(guān)疾病的治療會(huì)有突破性進(jìn)展。

［1］Yu J，Zhang L，Hwang PM，et al.puma induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells［J］.J Mol Cell，2001，7(3):673-682.

［2］Nakano K，Vousden KH.puma，a novel proapoptotic gene，is induced by p53［J］.J Mol Cell，2001，7(3):683-694.

［3］Ward MW，K?gel D，Prehn JH.Neuronal apoptosis:BH3-only proteins the real killers?［J］.J Bioenerg Biomembr，2004，4(36):295-298.

［4］Uo T，Kinoshita Y，Morrison RS.Apoptotic actions of p53 require transcriptional activation of puma and do not involve a direct mitochondrial/cytoplasmic site of action in postnatal cortical neurons［J］.J Neurosci，2007，27(45):12198-12210.

［5］Niizuma K，Endo H，Nito C，et al.Potential role of puma in delayed death of hippocampal CA1 neurons after transient global cerebral ischemia［J］.Stroke，2009，40(2):618-625.

［6］Kuroki K，Virard I，Concannon CG，et al.Effects of transient focal cerebral ischemia in mice deficient in puma［J］.Neurosci Lett，2009，451(3):237-240.

［7］Ghosh AP，Walls KC，Klocke BJ，et al.The proapoptotic BH3-only，Bcl-2 family member，puma is critical for acute ethanol-induced neuronal apoptosis［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2009，68(7):747-756.

［8］Cazanave SC，Mott JL，Elmi NA，et al.JNK1-dependent puma expression contributes to hepatocyte lipoapoptosis［J］.J Biol Chem，2009，284(39):26591-26602.

［9］McKenzie MD，Jamieson E，Jansen ES，et al.Glucose induces pancreatic islet cell apoptosis that requires the BH3-only proteins Bim and PUMA and multi-BH domain protein Bax［J］.Diabetes，2010，59(3):644-652.

［10］Waster PK，Ollinger KM.Redox-dependent translocation of p53 to mitochondria or nucleus in human melanocytes after UVA-and UVB-induced apoptosis［J］.J Invest Dermatol，2009，129(7):1769-1781.

［11］Karst AM，Dai DL，Martinka M，et al.puma expression is significantly reduced in human cutaneous melanomas［J］.Oncogene，2005，24(6):1111-1116.

［12］Brahmamdam P，Watanabe E，Unsinger J，et al.Targeted delivery of siRNA to cell death proteins in sepsis［J］.Shock，2009，32(2):131-139.

［13］Inoue S，Unsinger J，Davis CG，et al.IL-15 prevents apoptosis，reverse innate and adaptive immune dysfunction，and improves survival in sepsis［J］.J Immunol，2010，184(3):1401-1409.

［14］Obexer P，Hagenbuchner J，Rupp M，et al.p16INK4A Sensitizes human leukemia cells to FAS-and glucocorticoid-induced apoptosis via induction of BBC3/puma and repression of Mcl-1 and Bcl-2［J］.J Biol Chem，2009，284(45):30933-30940.

［15］Iglesias-Serret D，Piqué M，Barragán M，et al.Aspirin induces apoptosis in human leukemia cells independently of NF-kappaB and MAPKs through alteration of the Mcl-1/Noxa balance［J］.Apoptosis，2010，15(2):219-229.

［16］Hoque MO，Begum S，Sommer M，et al.PUMA in head and neck cancer［J］.Cancer Lett，2003，199(1):75-81.

［17］徐波，王保捷，李愛(ài)敏，等.糖皮質(zhì)激素對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病puma表達(dá)的影響［J］.中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2006，8(2):151-154.

［18］陳鑫，張尤歷，烏慧玲，等.puma基因在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)［J］.世界華人消化雜志，2010，18(12):1227-1231.

［19］Jansson A，Arbman G，Sun XF，et al.mRNA and protein expression of puma in sporadic colorectal cancer［J］.Oncol Rep，2004，12(6):1245-1249.

［20］王玉明，金克煒，李婭，等.非小細(xì)胞肺癌中puma基因外顯子突變和mRNA表達(dá)的分析［J］.中華病理學(xué)雜志，2009，38(2):121-122.

［21］Schonfeld-Dado E，F(xiàn)ishbein I，Segal M.Degeneration of cultured cortical neurons following prolonged inactivation:molecular mechanisms［J］.J Neurochem，2009，110(4):1203-1213.

［22］Hara H，Kamiya T，Adachi T，et al.Zinc induces expression of the BH3-only protein PUMA through p53 and ERK pathways in SHSY5Y neuroblastoma cells［J］.Neurochem Res，2009，34(8):1498-1506.

［23］El Golli Bennour E，Rodriguez-Enfedaque A，Bouaziz C，et al.Toxicities induced in cultured human hepatocarcinoma cells exposed to ochratoxin A:oxidative stress and apoptosis status［J］.J Biochem Mol Toxicol，2009，23(2):87-96.

［24］Uo T，Veenstra TD，Morrison RS.Histone deacetylase inhibitors prevent p53-dependent and p53-independent Bax-mediated neuronal apoptosis through two distinct mechanisms［J］.J Neurosci，2009，29(9):2824-2832.

［25］Shankar S，Davis R，Singh KP，et al.Suberoylanilide hydroxamic acid(Zolinza/vorinostat)sensitizes TRAIL-resistant breast cancer cells orthotopically implanted in BALB/c nude mice［J］.Mol Cancer Ther，2009，8(6):1596-1605.

［26］Hung AC，Porter AG.p53 mediates nitric oxide-induced apoptosis in murine neural progenitor cells［J］.Neurosci Lett，2009，467(3):241-246.

［27］Lam D，Dickens D，Reid EB，et al.MAP4K3 modulates cell death via the post-transcriptional regulation of BH3-only proteins［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(29):11978-11983.

［28］Sun Q，Ming L，Thomas SM，et al.puma mediates EGFR tyrosine kinase inhibitor-induced apoptosis in head and neck cancer cells［J］.Oncogene，2009，28(24):2348-2357.

［29］Komatsu S，Takenobu H，Ozaki T，et al.Plk1 regulates liver tumor cell death by phosphorylation of TAp63［J］.Oncogene，2009，28(41):3631-3641.

［30］Hershko T，Ginsberg D.Up-regulation of Bcl-2 homology 3(BH3)-only proteins by E2F1 mediates apoptosis［J］.J Biol Chem，2004，279(10):8627-8634.

［31］Lee MJ，Kim JY，Suk K，et al.Identification of the hypoxia-inducible factor 1 alpha-responsive HGTD-P gene as a mediator in the mitochondrial apoptotic pathway［J］.Mol Cell Biol，2004，24(9):3918-3927.

［32］You H，Pellegrini M，Tsuchihara K，et al.FoxO3a-dependent regulation of puma in response to cytokine/growth factor withdrawal［J］.J Exp Med，2006，203(7):1657-1663.