梁 寧(綜述)，單 利，王 強(審校)

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，烏魯木齊830011)

原發(fā)性支氣管肺癌(簡稱肺癌)為當前世界各地最常見的惡性腫瘤之一。在肺癌中，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占絕大多數(shù)。隨著近年新的治療方法和技術不斷涌現(xiàn)，使得NSCLC的診斷和治療較20世紀70年代有了長足的發(fā)展。腫瘤分子靶向治療是指針對參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的細胞信號轉導和其他生物學途徑的一種治療手段。它可以對腫瘤生長的關鍵通路采用小分子化合物阻斷其關鍵酶(酪氨酸激酶)，或采用各種單克隆抗體與其特異的生長因子或其受體進行競爭性結合，從而達到阻斷腫瘤細胞生長的作用。NSCLC靶向治療主要包括單克隆抗體、抑制酶/蛋白活性的小分子藥物、抗血管生成藥物、抑制蛋白翻譯的反義RNA以及與細胞內(nèi)分子特異性作用的藥物等。

1 棘皮動物微管結合蛋白4-間變淋巴瘤激酶融合基因的概述

在肺癌的分子靶向治療領域，研究熱點一直集中在表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、K-ras和血管內(nèi)皮生長因子等靶點上，涌現(xiàn)出許多針對這些靶點的分子靶向藥物。隨著對EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)研究的進一步深入及多中心的Ⅲ期臨床研究結果的陸續(xù)披露，靶向治療與患者臨床特征之間的關系越來越明確。同時也發(fā)現(xiàn)，不是所有優(yōu)勢人群(亞裔、女性、不吸煙、腺癌)都能夠通過EGFR-TKI獲益，EGFR突變狀態(tài)是決定EGFR-TKI療效的關鍵因素，使用EGFR-TKI后有些可以獲得疾病的長期緩解，有些會在TKI初始有效后出現(xiàn)獲得性耐藥，還有一些患者則原發(fā)性耐藥。目前已有研究證實［1］，EGFR 20號外顯子的突變與EGFR-TKI獲得性耐藥有關，而K-ras基因突變則與EGFR-TKI的原發(fā)耐藥有關［2］。棘皮動物微管結合蛋白4-間變淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4，EML4-ALK)融合基因與EGFR突變的不共存現(xiàn)象以及含有該基因患者的鮮明臨床特征，提示該靶點是肺腺癌特異性較高的分子標志物。ALK激酶的分子靶向藥物克里唑蒂尼(crizotinib)在晚期EML4-ALK融合基因陽性NSCLC患者的Ⅰ期臨床試驗中效果令人滿意，直接獲準進入Ⅲ期臨床研究［3］，備受關注。

2007年，Soda等［4］在1例62歲的吸煙肺腺癌患者手術切除的標本中，擴增出一個由3926 bp組成的DNA片段，可以編碼一個由1059個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白的氨基端(殘基1～496)是人類EML4編碼蛋白(基因庫編NM-019063)的一部分，而羧基端(殘基497～1059)則由ALK(基因庫編號AB209477)編碼蛋白的一部分構成。因此，研究者認為，編碼這一蛋白的基因很可能是EML4和ALK的融合基因。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該融合基因由第2號染色體短臂插入引起，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)6個變異亞型，分別為亞型1(E13;A20)、亞型2(E20;A20)、亞型3(E6a/b;A20)、亞型4(E14;A20)、亞型5(E2;A20)、亞型 6(E18;A20)［5，6］。經(jīng)檢測，所有這些融合基因均有生物學功能，表達產(chǎn)物為一種嵌合型酪氨酸激酶。

2 EML4-ALK與NSCLC的關系

前期的幾項研究表明，EML4-ALK的融合僅發(fā)生于肺腺癌患者。Soda等［7］首先發(fā)現(xiàn)了該融合基因，運用反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術檢測了261例惡性腫瘤(包括非霍奇金淋巴瘤、結直腸癌、胃腸道腫瘤)均未檢測出該基因。Inamura等［8］使用RT-PCR的方法檢測221例肺癌患者，其中腺癌149例，鱗癌48例，大細胞癌3例，小細胞癌21例，結果只在腺癌患者中檢測到5例有融合基因的mRNA表達，表達率為 3.4%(5/149)。Fukuyoshi等［9］檢測了肺癌(104例)、胃腸道腫瘤(555例)、乳腺癌(90例)等標本，發(fā)現(xiàn)104例肺癌標本中僅有1例EML4-ALK轉錄，而其余結果均為陰性，于是多數(shù)研究者認為，EML4-ALK屬NSCLC所獨有。但2009年，Lin等［5］在其他腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了 EML4-ALK，包括乳腺癌(5/209)，結直腸癌(2/83)，及 NSCLC(12/106)，但仍以NSCLC為最高。

3 EML4-ALK與EGFR-TKI的關系

多項研究發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKI有效的患者一般都有其獨特的臨床病理特征，如亞裔、女性、不吸煙、腺癌。進一步的研究證實，EGFR的19、21外顯子突變是決定EGFR-TKI療效的關鍵［10］。由此可見，擁有上述臨床病理特征的患者，EGFR突變的可能性大。那么，EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者是否有其獨特的臨床病理特征?Takahashi等［11］對2001年5月至2005年7月在京都大學醫(yī)學部胸外科診斷為NSCLC并接受手術治療的313例患者進行EML4-ALK融合基因發(fā)生率及相關因素分析的研究，該研究采用RT-PCR方法檢測腫瘤組織的EML4-ALK融合基因，并用直接測序法驗證，結果顯示，111例女性患者中4例有EML4-ALK融合基因，202例男性患者中僅有1例。所有EML4-ALK融合基因患者均為腺癌、少吸煙或不吸煙者且不與EGFR、K-RAS突變共存。Shaw等［12］研究了141例滿足兩個以上篩選條件(女性、亞裔、不吸煙或少吸煙、腺癌)的NSCLC患者。采用熒光原位雜交技術檢測EML4-ALK融合基因的發(fā)生率并用免疫組化方法檢測ALK表達水平，結果表明，13%的患者具有EML4-ALK融合基因，22%的患者EGFR突變，65%的患者兩者均為野生型。與EGFR基因突變和兩種基因均野生型的患者相比，EML4-ALK融合基因在年輕男性患者中更多。EML4-ALK融合基因患者與兩基因均野生型患者相比，不吸煙或少吸煙者更少。94.7%的 EML4-ALK融合基因存在于腺癌患者中，且此類融合基因患者接受EGFR-TKI治療后效果不明顯。Wong等［13］對266例NSCLC患者的手術冰凍標本進行EML4-ALK融合基因檢測，結果發(fā)現(xiàn)13例表現(xiàn)為EML4-ALK融合基因陽性，共包含4種變異亞型，其中8例為亞型3(E6;A20)，2例為亞型1(E13;A20)，2例為亞型2(E20;A20)，1例為亞型 5(E18;A20)。這 13例EML4-ALK融合基因陽性患者中，11例為腺癌，2例為腺鱗癌。此外，該研究發(fā)現(xiàn)不吸煙者的EML4-ALK融合基因陽性率更高;EGFR突變陰性與EML4-ALK融合基因陽性呈正相關;EML4-ALK融合基因陽性者較陰性者的年齡更小。隨著對EML4-ALK研究的不斷深入，EML4-ALK融合基因代表了NSCLC中具有獨特病理和臨床特征的新一類亞型。其主要存在于非吸煙或少吸煙的腺癌患者中，而且通常與EGFR基因不同時存在。

4 EML4-ALK基因的檢測方法

越來越多的標本進行了EML4-ALK融合基因的檢測，不同的檢測方法層出不窮，熒光原位雜交技術、RT-PCR、免疫組化、cDNA末端快速擴增技術均可檢測EML4-ALK融合基因，哪種檢測方法更快捷，敏感性、特異性更高成為了大家面臨的新問題。多數(shù)學者采用RT-PCR法進行EML4-ALK融合基因的檢測，也有研究者采用熒光原位雜交技術法檢測。Mino-Kenudson等［14］針對 ALK融合基因的新型抗體(美國細胞信號轉導技術公司的兔單克隆抗人CD246抗體，克隆號:D5F3或D9E4)，采用免疫組化法篩查來自臨床的石蠟標本，并通過PCR和熒光原位雜交技術等檢測方法進行驗證，結果顯示，與傳統(tǒng)檢測淋巴瘤ALK表達的小鼠來源標準抗體相比，敏感性、特異性均有明顯提高。Zhang等［15］運用cDNA末端快速擴增技術對廣東省人民醫(yī)院、廣東省肺癌研究所2003～2006年通過手術切除及穿刺活檢等手段獲得的103例NSCLC冷凍組織標本進行 EML4-ALK 融合基因檢測。Sakairi等［16］對109例經(jīng)支氣管鏡超聲內(nèi)鏡引導下縱隔淋巴結穿刺標本進行EML4-ALK融合基因檢測，得出了與原發(fā)灶組織標本檢測類似的結果。熒光原位雜交技術可以從病理切片或細胞涂片上檢測少數(shù)細胞的融合變異，是目前CrizotinibⅢ期臨床試驗的入組檢測方法，但有限的探針片段有時會降低其敏感性。免疫組化可檢測腫瘤特異性抗原的表達，但傳統(tǒng)免疫組化試劑敏感性較低，即使使用新型免疫組化試劑，結果也可能是微弱和局部的，此外，對結果的判斷也具有主觀性。RT-PCR的優(yōu)勢在于其檢測的高敏感性，但此法的缺點是:不能檢測EML4-ALK融合基因的未知亞型;對引物的要求高;檢測甲醛固定的石蠟包埋切片，RNA易大量降解而降低其敏感性。

5 針對EML4-ALK基因的抑制劑

任何一個腫瘤新靶點的發(fā)現(xiàn)，最后都著眼于設計出安全有效的藥物，在分子水平上治療腫瘤。由輝瑞公司研制的Crizotinib治療ALK融合基因陽性NSCLC患者的Ⅰ期臨床試驗初步結果顯示［17］，在50例可評價療效患者中，客觀緩解率達64%，8周疾病控制率達90%，6個月無進展生存率達72%，雖然中位無進展生存期尚未達到，但中位治療時間已超過25.5周。主要不良反應是胃腸道反應，但患者均可耐受。鑒于此，美國食品藥品管理局批準Crizotinib直接進入Ⅲ期臨床試驗。

6 結語

EML4-ALK融合變異目前已經(jīng)被鑒定為NSCLC，特別是肺腺癌的一個獨特的分子亞型，EML4-ALK融合基因陽性患者有其獨特的臨床病理特征，如何根據(jù)這些臨床病理特征，篩選ALK融合陽性的患者成為主要關注的問題。目前有多種技術可檢測EML4-ALK的融合，這些技術各有優(yōu)缺點，存在一定的互補性。研究初步顯示，Crizotinib治療ALK融合基因陽性NSCLC患者有效且不良反應可耐受。針對這一靶點的深入研究，將有助于篩選EGFR-TKI合適的治療人群并開啟NSCLC靶向治療的新領域。

［1］Bean J，Brennan C，Shih J，et al.MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib［J］.P Natl Acad Sci U S A，2007，104(52):20932-20937.

［2］Han SW，Kim TY，Jeon YK，et al.Optimization of patient selection for gefitinib in non-small cell lung cancer by combined analysis of epidermal growth factor receptor mutation，K-ras mutation，and Akt phosphorylation［J］.Clin Cancer Res，2006，12(8):2538-2544.

［3］Kwak EL，Camidge DR，Clark J，et al.Clinical activity observed in a phase I dose escalation trial of an oral c-met and ALK inhibitor，PF-02341066［J］.J Clin Oncol(Meeting Abstracts)，2009，27(15 Suppl):3509.

［4］Soda M，Choi YL，Enomoto M，et al.Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small cell lung cancer［J］.Nature，2007，448(7153):561-566.

［5］Lin E，Li L，Guan Y，et al.Exon array profiling detects EML4-ALK fusion in breast，colorectal，and non-small cell lung cancers［J］.Mol Cancer Res，2009，7(9):1466-1476.

［6］Takeuchi K，Choi YL，Togashi Y，et al.KIF5B-ALK，a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for ALK-positive lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，15(9):3143-3149.

［7］Soda M，Takada S，Takeuchi K，et al.A mouse model for EML4-ALK-positive lung cancer［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(50):19893-19897.

［8］Inamura K，Takeuchi K，Togashi Y，et al.EML4-ALK fusion is linked to histological characteristics in a subset of lung cancers［J］.J Thorac Oncol，2008，3(1):13-17.

［9］Fukuyoshi Y，Inoue H，Kita Y，et al.EML4-ALK fusion transcript is not found in gastrointestinal and breast cancers［J］.Br J Cancer，2008，98(9):1536-1539.

［10］Kim KS，Jeong JY，Kim YC，et al.Predictors of the response to gefitinib in refractory non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11(6):2244-2251.

［11］Takahashi T，Sonobe M，Kobayashi M，et al.Clinicopathologic features of non-small-cell lung cancer with EML4-ALK fusion gene［J］.Ann Surg Oncol，2010，17(3):889-897.

［12］Shaw AT，Yeap BY，Mino-Kenudson M，et al.Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK［J］.J Clin Oncol，2009，27(26):4247-4253.

［13］Wong DW，Leung EL，Kam-Ting K，et al.The EML4-ALK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild-type EGFR and K-ras［J］.Cancer，2009，115(8):1723-1733.

［14］Mino-Kenudson M，Chirieac LR，Law K，et al.A novel，highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry［J］.Clin Cancer Res，2010，16(5):1561-1571.

［15］Zhang X，Zhang S，Yang J，et al.Fusion of EML4 and ALK is associated with development of lung adenocarcinomas lacking EGFR and KRAS mutations and is correlated with ALK expression［J］.Mol Cancer，2010，9:188.

［16］Sakairi Y，Nakajima T，Yasufuku K，et al.EML4-ALK fusion gene assessment using metastatic lymphnode samples obtained by endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration［J］.Clin Cancer Res，2010，16(20):4938-4945.

［17］Bang Y，Kwak EL，Shaw AT，et al.Clinical activity of the oral ALK inhibitor，PF-02341066，in ALK-positive patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)［J］.J Clin Oncol(Meeting Abstracts)，2010，28(18 Suppl):3.