吳 靜，雷艷麗，金 堅(jiān)，鄔敏辰，陳 偉

(江南大學(xué)1.醫(yī)藥學(xué)院，2.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

金屬蛋白酶去整合素家族(A disintegrin and metalloproteinase，ADAM)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白家族，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)、釋放細(xì)胞因子和介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)功能［1］。在已發(fā)現(xiàn)的30多種ADAM家族成員中，ADAM15在人類多種實(shí)體瘤細(xì)胞(如乳腺癌、前列腺癌和直腸癌等)中過量表達(dá);該蛋白包含7個(gè)功能結(jié)構(gòu)域:前導(dǎo)域、類金屬蛋白酶功能域、去整合素功能域、富含半胱氨酸功能域、類表皮生長(zhǎng)因子功能域、跨膜域和C端的胞質(zhì)尾區(qū)，其中去整合素結(jié)構(gòu)域中含有整合素(Integrin)家族蛋白的特異識(shí)別序列〔RGD序列(Arg-Gly-Asp)〕，具有典型的藥物分子靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)與特征，有望用于指導(dǎo)抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)［2］。有研究報(bào)道ADAM15與黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和新生血管的形成密切相關(guān)［3-5］，但是國(guó)內(nèi)外關(guān)于 ADAM15對(duì)黑色素瘤細(xì)胞作用機(jī)制的研究報(bào)道并不多見。由于天然來源的ADAM15蛋白十分有限，獲得大量具有生物活性的重組ADAM15或其片段蛋白對(duì)深入研究ADAM15在腫瘤發(fā)展變化中的作用機(jī)制，指導(dǎo)新型靶向抗腫瘤藥物的研制具有重要意義。作者在前期研究工作中，已經(jīng)報(bào)道了制備重組人ADAM15去整合素結(jié)構(gòu)域蛋白(rhddADAM15)的方法［6］。本文以小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16)為研究模型，采用經(jīng)典分析方法，解析rhddADAM15對(duì)B16細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞周期等行為的影響，并初步檢測(cè)了rhddADAM15作用引起的B16細(xì)胞中p38MAPK激酶活性的變化，對(duì)rhddADAM15的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和細(xì)胞株 重組人rhddADAM15由本實(shí)驗(yàn)室制備，RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，MCDB-131培養(yǎng)基、牛血清白蛋白(BSA)、青霉素和鏈霉素等均購(gòu)自Sigma公司，噻唑蘭(MTT)購(gòu)自Biomol公司，Matrigel基質(zhì)蛋白購(gòu)自BD公司，侵襲小室Millicell購(gòu)自Millipore公司，胰酶、碘化丙啶(PI)和RNA酶A均購(gòu)自凱基生物公司，半胱天冬酶(caspase)-9抑制劑Z-LEHD-FMK、caspase活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16)購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，保存于液氮罐中。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)由法國(guó)國(guó)家衛(wèi)生醫(yī)藥研究院U553研究所(INSERM U553)陸核教授饋贈(zèng)，保存于液氮罐中。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) B16細(xì)胞采用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(1×105U·L-1的青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)至所需細(xì)胞量時(shí)，傾去培養(yǎng)液，加入5 ml 0.25%胰酶溶液消化，37℃保溫至細(xì)胞開始從瓶壁脫落前，傾去胰酶溶液，加入適量以上培養(yǎng)基，用玻璃吸管吹打至細(xì)胞全部從瓶壁脫落;血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至0.8×108～1.0×108·L-1;鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加100 μl細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后備用。HMEC-1細(xì)胞采用含10%小牛血清的MCDB-131 培養(yǎng)基(含 10 μg·L-1EGF，1 mg·L-1氫化可的松)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，同上常規(guī)培養(yǎng)及處理

1.2.2 MTT法測(cè)定rhddADAM15對(duì)細(xì)胞增殖的抑制 將rhddADAM15以培養(yǎng)基稀釋至系列濃度(0、2.5、5、7.5、10、12.5 和 15 mg·L-1)，加入培養(yǎng)至24 h的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每濃度點(diǎn)設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白孔及陰性對(duì)照孔，每實(shí)驗(yàn)孔均以培養(yǎng)基補(bǔ)至300 μl，培養(yǎng)24 h;小心吸去上清液，每孔加入180 μl新鮮培養(yǎng)基，再加 20 μl MTT 溶液(5 g·L-1，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液;每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm處測(cè)量各孔的吸光值(A570nm)。按以下公式計(jì)算平均抑制率:抑制率/%=(1-給藥組A570nm/對(duì)照組A570nm)×100%。繪制不同加藥濃度下的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50(抑制率為50%時(shí)藥物的濃度)。

1.2.3 細(xì)胞遷移試驗(yàn) 采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rhdd-ADAM15對(duì)B16細(xì)胞遷移的影響［7］，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化，再轉(zhuǎn)入全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，胰酶消化，24孔培養(yǎng)板每孔加入細(xì)胞5×105個(gè)，培養(yǎng)24 h，用無菌槍頭沿孔中心劃出約1 mm寬“傷痕”，PBS沖洗干凈，加入培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的rhddADAM15(0、5、7.5和10 mg·L-1)，每隔12 h觀察兩邊細(xì)胞向中間遷移的情況并拍照。

1.2.4 細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 采用經(jīng)典的Albini侵襲小室檢測(cè)rhddADAM15對(duì) B16細(xì)胞體外侵襲的影響［8］:在4℃融解Matrigel基質(zhì)蛋白膠，鋪于 millicell侵襲小室上下室之間的聚碳酸酯微孔膜上，備用。8%的胎牛血清(FBS)，置入侵襲小室的下室作為趨化因子液。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化離心，PBS洗3次，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力95%以上，用含有不同濃度的 rhddADAM15(0、2.5、5、7.5 和10 mg·L-1)培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至5×108·L-1，每個(gè)侵襲小室上室中加入含不同濃度rhddADAM15的細(xì)胞懸液200 μl(105個(gè)細(xì)胞)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，取下微孔膜，用乙醇棉球擦盡上表面細(xì)胞后，甲醛固定，蘇木精染色。顯微鏡下觀察穿入膜內(nèi)細(xì)胞，計(jì)數(shù)中間及四周5個(gè)高倍(400倍)鏡下視野細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均數(shù)。每組細(xì)胞5個(gè)樣本，計(jì)算平均數(shù)進(jìn)行比較。

1.2.5 rhddADAM15對(duì)細(xì)胞周期分布的影響 分別收集不同濃度rhddADAM15藥物組(0、5、7.5和10 mg·L-1)和空白對(duì)照組培養(yǎng)24 h后的B16細(xì)胞，移至10 mL的錐形管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。PBS洗滌2次，用500 μl的PBS重懸細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力。然后加入5 ml 70%冷乙醇4℃固定過夜。1 000 r·min-1離心5 min，棄乙醇。旋攪沉淀，用5 ml PBS+1%小牛血清清洗2次。用含1%小牛血清的800 μl PBS重懸細(xì)胞沉淀。加200 μl PI染色液和RNA酶A37℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每次計(jì)數(shù)105個(gè)細(xì)胞，用Cell Quest采集數(shù)據(jù)，ModFit LT3.0軟件分析細(xì)胞周期及凋亡峰。

1.2.6 Caspase酶活力測(cè)定 將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入rhddADAM15使終濃度為7.5 mg·L-1分別于0、12、24和36 h收集細(xì)胞。按照試劑盒提供方法測(cè)定caspase酶活力。

1.2.7 Caspase-9抑制劑對(duì)rhddADAM15抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 按“1.2.1”方法培養(yǎng)細(xì)胞，加入終濃度為12 μmol·L-1的Z-LEHD-FMK共培養(yǎng)2 h后，加入rhddADAM15使終濃度為0、5、7.5和10 mg·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按1.2.2方法測(cè)定抑制率。

1.2.8 B16細(xì)胞p38 MAPK激酶活性測(cè)定

1.2.8.1 制備B16細(xì)胞裂解液 B16細(xì)胞同步化后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)液中加入rhddADAM15至不同終濃度 (0、5、7.5和10 mg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，EDTA消化，收集大量B16細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞數(shù)次，加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液(1%Triton X-100，1%NP-40，0.125 mol·L-1EDTA，0.1 mmol·L-1PMSF，150 mmol·L-1NaCl，25 mmol·L-1Tris-Cl，pH 7.4，0.1%完全蛋白酶抑制劑)，冰浴下將細(xì)胞與玻璃珠懸浮混勻，劇烈振蕩，重復(fù)數(shù)次，靜置30 min，離心(4℃ ，12 00 r·min-1，20 min)，收集上清混合蛋白質(zhì)溶液，備用。

1.2.8.2 p38MAPK激酶活性測(cè)定 Bradford法測(cè)定蛋白濃度，各取蛋白40 μg變性，SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)，TBST緩沖液(5%脫脂奶粉)封閉1 h。NC膜分別與p-p38單克隆抗體(1∶1 000)或兔抗p38MAPK多克隆抗體(1∶1 000)4℃下孵育過夜，TBST洗滌4次，加入相應(yīng)的二抗37℃孵育2 h，TBST洗滌3次，加入DAB顯色液顯色，薄層掃描儀測(cè)定印跡區(qū)帶的光密度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，細(xì)胞抑制試驗(yàn)重復(fù)3次以上，生長(zhǎng)抑制率與藥物濃度的關(guān)系用直線回歸與相關(guān)分析，細(xì)胞侵襲和遷移試驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)和p38MAPK激酶活性試驗(yàn)重復(fù)2次以上，分別拍照或測(cè)定相關(guān)值。

2 結(jié)果

2.1 rhddADAM15抑制腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng) MTT法檢測(cè)顯示rhddADAM15可以體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞HEMC-1和腫瘤細(xì)胞B16的生長(zhǎng)，抑制作用隨著rhddADAM15濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴性，IC50分別為18.02和13.80 mg·L-1。另一方面，當(dāng)rhddADAM15濃度為7.5 mg·L-1時(shí)，rhdd-ADAM15對(duì) B16細(xì)胞的抑制率比 HMEC-1高出81.3%(P＜0.01)。這一結(jié)果表明，同一濃度的rhddADAM15對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用強(qiáng)于內(nèi)皮細(xì)胞，差異具有顯著性，從而證實(shí)了rhddADAM15具有體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的生物功能。為排除rhdd-ADAM15對(duì)B16細(xì)胞遷移和侵襲的作用是由于細(xì)胞活力受抑制引起的，實(shí)驗(yàn)中采用的藥物濃度是2.5、5、7.5 和 10 mg·L-1。

Fig 1 Curves of the inhibitory rate of rhddADAM15 on HMEC-1 and B16 cells(24 h，n=4)

2.2 rhddADAM15抑制B16細(xì)胞的侵襲和遷移

Albini侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rhddADAM15可明顯抑制B16細(xì)胞對(duì)Matrigel基質(zhì)膠的破壞作用，從而阻止細(xì)胞的侵襲，隨著rhddADAM15濃度的增加，進(jìn)入微孔膜中的細(xì)胞數(shù)量明顯下降，當(dāng)rhddADAM15濃度為7.5和10 mg·L-1時(shí)，與對(duì)照組(未添加rhddADAM15)比較，侵襲細(xì)胞數(shù)量分別下降了0.55和0.87。另一方面，劃痕實(shí)驗(yàn)表明rhddADAM15對(duì)B16細(xì)胞遷移也有明顯抑制作用。rhddADAM15(7.5 mg·L-1)與B16細(xì)胞共培養(yǎng)12和24 h時(shí)，與對(duì)照組比較，對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用與時(shí)間成正比。

Fig 2 Inhibitory effect of rhddADAM15 on the invasion of B16 cells(12 h，n=5)

Fig 3 Inhibitory effect of rhddADAM15(7.5 mg·L－1)on the migration of B16 cells(×40).(n=3)

2.3 rhddADAM15對(duì)B16的細(xì)胞周期的影響 如Tab 1所示，與對(duì)照組相比，rhddADAM15作用使得S期細(xì)胞數(shù)量減少，G2/M期細(xì)胞的數(shù)量增加，而且這種影響呈現(xiàn)出濃度依賴型，但在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的凋亡現(xiàn)象并不明顯。

Tab1 Effect of rhddADAM15 on B16 cell cycle distribution(±s，n=4)

Tab1 Effect of rhddADAM15 on B16 cell cycle distribution(±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

rhddADAM15/mg·L-1 Cell cycle distribution/%G0/G1 S G2/M Control 60.67±12.31 29.39±6.43 9.94±2.32 5 63.24±9.41* 20.45±4.33* 16.31±4.29*7.5 67.46±17.14* 9.43±2.50* 23.11±5.20*10 66.83±15.46＊＊ 4.40±1.09＊＊28.77±5.87＊＊

2.4 rhddADAM15對(duì)B16細(xì)胞中Caspase酶活力的影響及caspase-9抑制劑對(duì)rhddADAM15作用的干擾 如Tab 2所示:rhddADAM15在濃度為7.5 mg·L-1時(shí)對(duì)B16細(xì)胞中caspase-3和 caspase-9酶活力的影響并不明顯，只是在作用36 h后有一定升高。另外，caspase-9抑制劑可部分降低 rhddADAM15對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，與未添加caspase-9抑制劑的對(duì)照組相比，rhddADAM15(5、7.5和10 mg·L-1)作用抑制率分別降低了1.6%、2.3%和5.1%(P＜0.05)。

Tab 2Effect of rhddADAM15 on caspases in B16 cells(±s，n=4)

Tab 2Effect of rhddADAM15 on caspases in B16 cells(±s，n=4)

*P＜0.05 vs control

Time/h Enzyme activity/U caspase-3 caspase-9 0 2.54±0.67 0.19±0.03 12 2.30±0.41 0.25±0.04 24 3.27±0.64 0.29±0.05 36 5.83±0.46* 0.50±0.07*

2.5 rhddADAM15對(duì)B16細(xì)胞中p38激酶活性的影響 Western blot結(jié)果如Fig 4所示:p-p38表示被激活的p38激酶，隨著rhddADAM15濃度的不斷增加，p38激酶磷酸化水平不斷增高，p-p38/p38的比例升高，當(dāng)rhddADAM15為10 mg·L-1時(shí)，p38激酶的磷酸化程度達(dá)0.80，但總的p38激酶表達(dá)水平并不隨rhddADAM15濃度的增加而增加，對(duì)照組p38激酶磷酸化不明顯。

3 討論

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移包括腫瘤生長(zhǎng)侵襲、細(xì)胞脫落進(jìn)入循環(huán)流動(dòng)、與脈管內(nèi)皮或組織基質(zhì)黏附、通過組織和間隙變形移動(dòng)、降解破壞細(xì)胞間質(zhì)和定植生長(zhǎng)等主要過程。侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性程度的重要生物學(xué)特性和影響腫瘤預(yù)后的主要因素，因此對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究對(duì)腫瘤治療方案的選擇和判斷預(yù)后具有重要的意義。已有研究表明，rhddADAM15具有抑制乳腺癌MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤新生血管形成的功能，對(duì)接種B16腫瘤小鼠的肺轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用［4］，還可以通過與細(xì)胞表面整合素α5β1的相互作用抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移［9］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhddADAM15對(duì)B16細(xì)胞體外增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性抑制細(xì)胞侵襲，時(shí)間依賴性抑制細(xì)胞遷移，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，其抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與影響細(xì)胞間相互識(shí)別以及細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)之間的相互作用有關(guān)。

Fig 4 p38 activation in B16 cells incluced by rhddADM15(24 h，n=3).*P＜0.05 vs control(0 mg·L-1)

腫瘤細(xì)胞最基本的特征是細(xì)胞平衡機(jī)制失衡。細(xì)胞不受控制地異常增殖，而失控性增殖的根本原因就在于細(xì)胞周期的監(jiān)控機(jī)制——細(xì)胞周期檢查點(diǎn)被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化和死亡機(jī)制的紊亂，因此，選擇能同時(shí)破壞細(xì)胞并引起凋亡的藥物，以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期將是今后高效治療腫瘤的新策略［10］。在研究rhddADAM15作用對(duì)細(xì)胞周期影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，rhddADAM15主要是將B16細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而延緩細(xì)胞生長(zhǎng)速度，使得細(xì)胞體外增殖受到明顯抑制，但沒有發(fā)現(xiàn)直接證據(jù)表明rhddADAM15能夠促使B16細(xì)胞產(chǎn)生壞死或凋亡的現(xiàn)象，提示rhdd-ADAM15對(duì)B16細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能不是通過直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步研究rhddADAM15對(duì)細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行蛋白caspase蛋白酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)(36 h)，caspase酶活性有一定提高，但不明顯，同時(shí)caspase酶抑制劑可以部分降低較高濃度rhddADAM15(10 mg·L-1)對(duì) B16細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，提示caspase信號(hào)通路可能參與了rhddADAM15誘導(dǎo)的B16細(xì)胞死亡，但具體作用方式還有待深入研究。Trochon-Joseph等［4］研究重組表達(dá)的 ADAM15去整合素蛋白片段(RDD)對(duì)牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(CPAE)凋亡的影響時(shí)，也發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象不明顯;B?hm等［11］則報(bào)道 ADAM15對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞具有抗凋亡作用，與本文的結(jié)果相似。

真核細(xì)胞中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路擔(dān)負(fù)著將胞外各種有絲分裂和應(yīng)急信號(hào)傳遞至胞核，并調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要使命，在細(xì)胞惡變和腫瘤發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。通過調(diào)節(jié)不同MAPK通路的活性可控制細(xì)胞的存活與死亡。p38信號(hào)通路是MAPK通路的重要分支，已有研究表明，p38通路在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、激活G2期檢測(cè)點(diǎn)、引起G2/M期阻滯中發(fā)揮重要作用:Afrasiabi等［12］研究神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽堿(sphingosylphosphorylcholine，SPC)抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和遷移時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著G2/M的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，MAPK信號(hào)通路成員的磷酸化水平明顯降低，表明SPC的抑制作用是通過調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的;然而，關(guān)于ADAM15與p38信號(hào)通路相關(guān)性的報(bào)道則很少:ADAM15通過抑制Erk通路引起細(xì)胞表面整合素α5β1聚集而抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，通過調(diào)節(jié)Src/ERK1/2 信號(hào)通路調(diào)控中性粒細(xì)胞遷移信號(hào)［9，13］;另一方面，p38蛋白激酶級(jí)聯(lián)的信號(hào)傳遞是通過蛋白質(zhì)的磷酸化來完成的。如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的p38MAPK的激活是通過一種有序的激酶級(jí)聯(lián)(MAPKKK→MAPKK→MAPK)而實(shí)現(xiàn)的。改變蛋白激酶信號(hào)分子的某個(gè)(些)氨基酸，會(huì)影響其三維結(jié)構(gòu)，從而激活或抑制信號(hào)分子的生物學(xué)活性。在本研究結(jié)果中，rhddADAM15作用使p38激酶磷酸化而激活，隨著rhddADAM15濃度的提高，p38激酶磷酸化程度加強(qiáng)，活性增強(qiáng)，提示p38MAPK信號(hào)通路可能參與了rhddADAM15調(diào)控B16細(xì)胞行為的過程。但是 rhddADAM15激活p38信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)激活過程還有待后續(xù)研究中進(jìn)一步闡明，同時(shí)在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們還將繼續(xù)研究rhddADAM15調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路的機(jī)制，如p38激酶特異性抑制劑的阻斷是否影響rhddADAM15對(duì)B16細(xì)胞行為的調(diào)控等。

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