莫利求，蘭愛(ài)平，林 琳，周 舸，張莉莉，楊春濤，王秀玉，楊戰(zhàn)利，陳培熹，馮鑒強(qiáng)，

目前，α2腎上腺素受體激動(dòng)劑(alpha(α)-2-adrenoreceptor agonist)在麻醉及重癥監(jiān)護(hù)治療中的作用日益受到重視。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種強(qiáng)效的，高度選擇性的α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，對(duì)人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有多種作用，例如臨床鎮(zhèn)靜、輕度的麻醉及鎮(zhèn)痛作用等［1－2］。近年的實(shí)驗(yàn)研究證明，DEX還有神經(jīng)保護(hù)作用。在剝奪氧氣和葡萄糖(模擬缺血)的大鼠海馬腦片實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停珼ahmani等［3］觀察到，DEX能減少神經(jīng)元死亡及凋亡效應(yīng)器Caspase-3表達(dá)，此神經(jīng)保護(hù)作用可能與激活α2腎上腺素受體，繼而促進(jìn)灶性黏附激酶(focal adhesion kinase)的表達(dá)有關(guān)。然而，DEX能否保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)抗化學(xué)性缺氧引起的損傷尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本文應(yīng)用化學(xué)性低氧模擬劑氯化鈷(CoCl2)處理具有神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)特征的PC12細(xì)胞。以建立化學(xué)性低氧神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，旨在探討:①DEX能否抑制CoCl2的細(xì)胞毒性及致凋亡作用?②DEX能否抑制活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成?③ DEX是否具有線粒體保護(hù)作用?通過(guò)上述研究為深入闡明DEX的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制提供新穎的實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 材料 DEX由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供。CoCl2，Hoechst33258，DCFH-DA，Rh123購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo Lab，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及預(yù)處理方法 PC12細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，置于含10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。DEX處理按如下程序?qū)嵤?400 μmol·L－1DEX 與 600 μmol·L－1CoCl2共同作用PC12細(xì)胞24 h。

1.3 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，以 1 ×107·L－1接種于 96 孔板，100 μl/孔。在37℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜后，按實(shí)驗(yàn)要求給予不同處理，每孔設(shè)8個(gè)平行孔，處理完后，每孔加入10 μl的 CCK-8，37℃繼續(xù)孵育 4 h，用酶標(biāo)儀(450 nm)記錄各孔的吸光度(OD)。取4孔OD值的平均數(shù)，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率/%=處理組OD/對(duì)照組OD×100% ，重復(fù)3次。

1.4 Hoechst 33258核染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量 將PC12細(xì)胞(1×107·L－1)接種于35mm的小號(hào)培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組按要求給予不同的處理因素后，加入新鮮配置的4%多聚甲醛(pH=7.4)于4℃固定細(xì)胞10 min，用 PBS洗2次，加入5 mg·L－1Hoechst 33258染色液染色10 min，用 PBS洗2遍，加入適量的PBS后用熒光顯微鏡觀察，攝片。正常細(xì)胞核出現(xiàn)彌散均勻的低密度熒光;細(xì)胞核呈固縮形態(tài)或顆粒狀熒光，計(jì)為凋亡細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定 DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后，可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH，而DCFH不能自由通透細(xì)胞膜，從而將探針裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的ROS可將無(wú)熒光的DCFH氧化成發(fā)出綠色熒光的DCF，綠色熒光的強(qiáng)弱可以間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將細(xì)胞接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，倒掉培養(yǎng)液，用無(wú)血清的低糖培養(yǎng)液洗兩次，隨后用10 μmol·L－1DCFH-DA 染液于37℃孵育60 min。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取不重復(fù)的區(qū)域攝片，用Image J 1.41.軟件的COLOR Hitogram模塊計(jì)算出5個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對(duì)各組的樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 線粒體膜電位(MMP)的檢測(cè) Rh123是一種能夠被線粒體所吸收的熒光染料，線粒體對(duì)其攝取能力取決于其跨膜電位。根據(jù)熒光強(qiáng)度可以間接反映MMP的高低，將細(xì)胞接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，倒掉培養(yǎng)液，用不含血清的低糖培養(yǎng)液洗兩次，隨后在含100 μg·L－1Rh123的無(wú)血清的培養(yǎng)基中37℃孵育45 min，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取不重復(fù)的區(qū)域攝片，細(xì)胞核周?chē)木G色亮點(diǎn)即為攝取了Rh123的線粒體。用Image J 1.41.軟件的COLOR Hitogram模塊計(jì)算出5個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對(duì)各組的樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有結(jié)果以±s表示，組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)，用LSD進(jìn)行均數(shù)之間的比較。

2 結(jié)果

2.1 DEX抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性 Fig 1結(jié)果顯示，600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細(xì)胞 24 h后，使細(xì)胞存活率降低至 39.9% ±2.2%(P＜0.01)，提示CoCl2能產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。在600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12細(xì)胞的同時(shí)，應(yīng)用100～600 μmol·L－1DEX 作用于細(xì)胞能明顯的抑制CoCl2的細(xì)胞毒性，其中400 μmol·L－1DEX 使細(xì)胞存活率升高至(59.3±2.1)%，與CoCl2處理組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜ 0.01)，400 μmol·L－1DEX本身對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)影響。

Fig 1 Effect of dexmedetomidine on cytotoxicity induced by CoCl2＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs CoCl2 group;dexmedetomidine:DEX

Fig 2 CoCl2-induced apoptosis in PC12 cells inhibited by dexmedetomidineAa:Control group，Ab:400 μmol·L －1DEX group，Ac:600 μmol·L－1CoCl2group，Ad:CoCl2+DEX group.##P ＜ 0.01 vs control group，＊＊P ＜0.01 vs CoCl2group.Bar=20 μm.

2.2 DEX抑制CoCl2的致細(xì)胞凋亡作用 Fig 2顯示 Hoechst33258核染色法檢測(cè)結(jié)果，600 μmol·L－1CoCl2處理PC12細(xì)胞48h后，使凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多，凋亡率達(dá)36% ±1.2%。在600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12細(xì)胞的同時(shí)，應(yīng)用400 μmol·L－1DEX抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，使凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，凋亡率降低到22% ±2.2%。400 μmol·L－1DEX本身不引起細(xì)胞凋亡。

2.3 DEX抑制CoCl2誘導(dǎo)的ROS過(guò)度生成 Fig 3 結(jié)果顯示，600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細(xì)胞6h后，使細(xì)胞內(nèi)ROS水平比正常對(duì)照組高2.8倍(MFI為 24.7 ±1.4)(P ＜0.01)。在 600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細(xì)胞同時(shí)，應(yīng)用400 μmol·L－1DEX作用于細(xì)胞能抑制CoCl2促進(jìn)ROS生成作用，使 MFI降低至 15.5 ±2.2(P ＜0.01)。400 μmol·L－1DEX本身對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平無(wú)影響。

Fig 3 CoCl2-induced overproduction of ROS in PC12 cells reduced by dexmedetomidineAa:Control group，Ab:400 μmol·L －1DEX group，Ac:600 μmol·L－1CoCl2group，Ad:CoCl2+DEX group.##P ＜0.01 vs control group，＊＊P ＜0.01 vs CoCl2group.Bar=20 μm.

2.4 DEX抑制CoCl2對(duì)線粒體膜電位的損傷作用Fig 4 結(jié)果顯示，600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12細(xì)胞24h后，使細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度(MFI，反映MMP大小的指標(biāo))從47.2±2.7(對(duì)照組)降到18.5±2.2(P＜0.01)，提示 CoCl2能損傷線粒體，使MMP 降低。然而，在 600 μmol·L－1CoCl2處理PC12細(xì)胞同時(shí)，應(yīng)用 400 μmol·L－1DEX 作用細(xì)胞，能阻斷CoCl2降低 MMP的作用，MFI升高至34.5±2.1(P＜0.01)。

Fig 4 Inhibitory effect of CoCl2on MMP in PC12 cells block by dexmedetomidineAa:Control group，Ab:400 μmol·L －1DEX group，Ac:600 μmol·L－1CoCl2group，Ad:CoCl2+DEX group.##P ＜ 0.01 vs control group，＊＊P ＜0.01 vs CoCl2group.DEX，Bar=10 μm.

3 討論

CoCl2是一種化學(xué)性低氧模擬劑，在不同的細(xì)胞能模擬低氧/缺氧性損傷，表現(xiàn)為促進(jìn)活性氧(ROS)生成［4－5］，降低線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)［4，6］，并引起細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡［4－7］。因此，本文應(yīng)用 CoCl2處理具有神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能特征的PC12細(xì)胞，以探討α2腎上腺素受體激動(dòng)劑DEX能否保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗化學(xué)性低氧引起的損傷。

本文證實(shí)，在 100 ～ 600 μmol·L－1濃度范圍內(nèi)，DEX能濃度依賴性地抑制CoCl2引起的細(xì)胞毒性，使PC12細(xì)胞存活率明顯提高。同時(shí)，我們也注意到 50 μmol·L－1或 800 μmol·L－1DEX 雖然也能提高PC12細(xì)胞的存活率，但與對(duì)照組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，這提示DEX的抗細(xì)胞毒性作用存在一定濃度范圍，濃度偏低或過(guò)高可能會(huì)影響其細(xì)胞保護(hù)作用，其有關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。另一方面，DEX也能抑制CoCl2的致細(xì)胞凋亡作用，使細(xì)胞凋亡數(shù)量減少。上述結(jié)果提示，DEX能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)抗化學(xué)性低氧引起的損傷。最近Jean等［8］報(bào)道，應(yīng)用DEX預(yù)處理或后處理(postconditioning)小鼠海馬腦片后能保護(hù)海馬神經(jīng)元對(duì)抗缺血損傷，這與本文的結(jié)果相吻合，并提示DEX可在不同的缺氧或缺血細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

為了進(jìn)一步探討DEX保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗化學(xué)性低氧引起的損傷的作用機(jī)制，本文觀察了DEX對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的ROS過(guò)度生成的作用。ROS(包括超氧陰離子、H2O2等)被認(rèn)為是缺氧/缺血性損傷的一個(gè)重要因素。ROS可快速地影響膜脂質(zhì)、酶及其它重要的細(xì)胞成分，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。ROS也可通過(guò)線粒體-ATP敏感性鉀通道及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)等途徑損傷線粒體功能［9］。本文證實(shí)，DEX能明顯的抑制CoCl2誘導(dǎo)的ROS過(guò)度生成，提示DEX具有抗氧化應(yīng)激作用，抑制ROS過(guò)度生成可能是DEX的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)組在另一實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用ROS抑制劑NAC后也能抑制CoCl2誘導(dǎo)的損傷，進(jìn)一步證實(shí)了這一推斷。

本文還觀察到 DEX能明顯地對(duì)抗 CoCl2對(duì)MMP的損傷作用，使MMP丟失減小。MMP的穩(wěn)定是產(chǎn)生ATP及維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)所必需的，是影響細(xì)胞生存的一個(gè)重要因素［10］。因此，本文推測(cè)，對(duì)抗CoCl2對(duì)MMP的降低作用可能是DEX另一神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

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