付愛玲，王逸麟

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種臨床常見的神經(jīng)退行性疾病。PD的病理特征主要是中腦黑質致密部，出現(xiàn)明顯的多巴胺神經(jīng)元缺失，導致其靶組織紋狀體內多巴胺水平降低，從而引起運動失調和認知功能障礙。

在嚙齒類動物模型中，大鼠前腦內側束(median forebrain bundle，MFB)內單側注射 6-羥多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)制備的PD模型得到了廣泛的應用［1］。然而，這個模型存在的主要問題是成功率較低，平均30% ～40%。小鼠腹腔注射神經(jīng)毒素 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)也用以制備PD模型［2］，但MPTP注射引起的是雙側PD癥狀，不能進行基于一側損傷所產(chǎn)生的行為學檢測［3］。6-OHDA能夠選擇性地破壞兒茶酚胺類神經(jīng)元，單側腦內注射后，通過檢測單側偏倚，易于評估運動損傷［4］。另外，6-OHDA能夠阻斷腦內的黑質紋狀體通路，導致多巴胺能神經(jīng)元的退化，在較長的時間內可產(chǎn)生穩(wěn)定的運動損傷，有利于篩選有效藥物［5］。

至今在國內尚未見小鼠6-OHDA腦內注射制備PD模型的報道?？赡艿脑蚴切∈驧FB區(qū)域較小，難以進行局部腦內注射。本研究中，我們將6-OHDA單側注射入小鼠腦區(qū)面積較大的紋狀體內，使用與大鼠PD模型相同的方法進行行為學檢測和生化指標測定，并與大鼠PD模型進行對比實驗。結果表明，小鼠6-OHDA單側紋狀體內注射可成功制作急性PD模型，成功率為95%，持續(xù)時間大約4周。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康♂SD大鼠(200～250 g)和C57BL/6小鼠(25～30 g)，重慶醫(yī)科大學動物中心提供。6-羥多巴氫溴酸(6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA·HBr)、阿樸嗎啡、安非他命、NADPH、四氫葉酸、過氧化氫酶、Fe(NH4)2(SO4)2和L-酪氨酸均購自Sigma公司。3H-L-酪氨酸和Ultima gold閃爍液購自Perkin Elmer公司。其他試劑均為分析純。6-OHDA·HBr臨用前溶解在0.02%抗壞血酸溶液中，終濃度為3 g·L-1。

1.2 小鼠單側紋狀體內注射6-OHDA制備PD模型 小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.01 ml·g-1)。將動物固定在立體定位儀上，沿顱頂正中矢切開皮膚，脫脂棉輕輕搽拭暴露前囟(Bregma)。在前囟后1.0 mm、中線旁2.1 mm，以及前囟后0.3 mm、中線旁2.3 mm處打孔。分別用微量進樣器緩慢注入6-OHDA·HBr溶液2 μl(顱骨下2.9 mm)，注射后留針1 min，退出進樣器，縫合處理創(chuàng)面。

1.3 大鼠PD模型的制備 將大鼠預先腹腔注射去甲丙咪嗪(25 μg·g-1)。然后腹腔注射水合氯醛麻醉后，將動物固定于腦立體定位儀。沿顱頂正中矢切開皮膚，3%過氧化氫溶液去除皮下粘膜。于前囟后-4.0 mm、中線旁1.6 mm處開顱。微量進樣器插入左側前腦內側束。在給予去甲丙咪嗪30min后，微量進樣器注射入6-OHDA溶液4 μl(顱骨下8.0 mm)，注射速度為0.5 μl·min-1。注射后留針8min后緩慢退出進樣器，縫合創(chuàng)面。

1.4 動物行為測試 在手術后的1～5周，腹腔注射1 μg·g-1阿樸嗎啡(0.5 g·L-1)，將動物放于40 cm直徑的圓底鍋內，計數(shù)20 min內動物向給藥對側旋轉的圈數(shù)(旋轉360度計為一圈)。在給予阿樸嗎啡的d 1，腹腔注射2.5 μg·g-1的安非他命(0.5 g·L-1)，計算20 min內動物向給藥側旋轉的圈數(shù)。旋轉次數(shù)以每分鐘圈數(shù)(rotation·min-1)表示。

1.5 酪氨酸羥化酶活性測定 采用同位素法進行測定動物皮層和紋狀體內酪氨酸羥化酶的活性［6］。脫臼處死小鼠，取出大腦，快速分離皮層、左右側紋狀體。測定時按照1∶10的比例加入磷酸緩沖液，冰浴中勻漿。于200 μl勻漿液中加入100 μl反應液(磷酸緩沖液中含有11.8 g·L-1NADPH，7.6 g·L-1四氫葉酸，233 g·L-1過氧化氫酶，10 mmol·L-1Fe(NH4)2(SO4)2，1.5 mmol·L-1L-酪氨酸，5.18 × 105Bq3H-L-酪氨酸)?；靹蚝笤?7℃ 孵育30 min，加入1.0 ml的7.5%活性碳終止反應。離心，吸取200 μl上清液，轉移到液閃瓶中，加入10 ml Ultima gold閃爍液，混勻，于液閃計數(shù)器上進行測定。勻漿液蛋白含量用Lowry法測定。酪氨酸羥化酶活性以nmol·h-1·g-1Pro表示。

2 結果

實驗共使用了20只C57/BL小鼠和20只SD大鼠。小鼠手術后有1只在1周內死亡，總成功率為95%;SD大鼠，9只未成功，2只大鼠手術后1周內死亡，成功率為45%。

2.1 阿樸嗎啡誘發(fā)的旋轉 大鼠給予6-OHDA后1周，動物開始出現(xiàn)旋轉行為，隨著時間延長，旋轉次數(shù)逐漸增多。一般認為，平均每分鐘旋轉7次以上者，被認為是成功的PD模型。小鼠注射6-OHDA后也出現(xiàn)了明顯的旋轉行為，第2周時，平均每分鐘旋轉次數(shù)已達到9次以上(9.9±1.0)，但第3周后，次數(shù)開始下降，至第5周下降至7.5次(7.5±0.9)(Fig 1)。這個結果表明，小鼠注射6-OHDA制備的PD模型能夠持續(xù)4周左右，可用作PD的急性模型。

Fig 1 Comparison of apomorphine-induced rotation between rats and mice

2.2 安非他命誘發(fā)的旋轉 安非他命誘發(fā)動物旋轉的實驗結果與阿樸嗎啡相似。小鼠注射6-OHDA第2周，旋轉次數(shù)已達到7次以上，第3周時開始下降，至第5周時下降至5.1次(Fig 2)。這個結果確定，小鼠注射6-OHDA制備的PD急性模型是穩(wěn)定的，對不同的所試藥物均可出現(xiàn)相應的反應。

Fig 2 Comparison of amphetamine-induced rotation between rats and mice

2.3 皮層和紋狀體內TH活性的測定 結果顯示，大鼠左側(未注射側)紋狀體內TH活性正常，而注射側TH活性明顯降低。這與文獻報道一致［7］。小鼠注射6-OHDA后，實驗結果與大鼠相似(Fig 3)。表明小鼠單側紋狀體內注射6-OHDA后，可引起了多巴能神經(jīng)元損傷，導致TH活性下降。

3 討論

大鼠MFB內注射6-OHDA是常用的PD模型。但該模型成功率較低。原因可能是MFB區(qū)域比較狹窄，對操作的要求非常嚴格。6-OHDA單側損毀制備PD模型的優(yōu)勢在于旋轉癥狀可以量化，容易評價抗PD藥物和治療方法的療效。

在一些藥物研究中，使用小鼠比大鼠更加有利，因此我們選擇小鼠進行PD模型實驗。結果證明，小鼠注射6-OHDA制備的PD模型能夠持續(xù)4周左右，可用作急性模型。該模型是穩(wěn)定、有效，對不同的所試藥物可出現(xiàn)相應的反應。推測國內常用的昆明種小鼠，也可能會出現(xiàn)相似的結果。

Fig 3 Measurement of TH activity in cortex，left and right striatum*P＜0.05 vs respective left striatum.

TH是兒茶酚胺類活性物質生物合成的限速酶，它的活性可作為多巴能神經(jīng)元的指標［8］。本實驗中，我們采用同位素法檢測大鼠和小鼠皮層、左右紋狀體內TH活性。結果表明，動物注射6-OHDA后，對皮層和非注射側的紋狀體內的TH活性沒有影響，而注射側的TH活性明顯下降，說明動物的行為變化與TH活性下降有關。

總之，本文介紹的小鼠PD模型簡單易行、成功率高，并且可出現(xiàn)與大鼠PD模型相似的行為學特征和生化指標的變化。以上結果證明，小鼠6-OHDA單側紋狀體內注射可用于制作急性PD模型。

［1］Wu S P，F(xiàn)u A L，Wang Y X，et al.A novel therapeutic approach to 6-OHDA-induced Parkinson’s disease in rats via supplementation of PTD-conjugated tyrosine hydroxylase［J］.Biochem Bioph Res Co，2006，346(1):1-6.

［2］馬 成，馬 龍，RAUSCH Wolf-dieter.大花羅布麻對MPTP型小鼠的多巴胺能神經(jīng)保護作用研究［J］.中國藥理學通報，2010，26(3):397-400.

［2］Ma C，Ma L，RAUSCH Wolf-dieter.Dopaminergic neuroprotection of Poacynum hendersonni in MPTP mouse［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):397-400.

［3］Fox S H，Brotchie J M.The MPTP-lesioned non-human primate models of Parkinson’s disease.Past，present，and future［J］.Prog Brain Res，2010，184:133-57.

［4］Esposito E，Cuzzocrea S.New therapeutic strategy for Parkinson′s and Alzheimer’s disease［J］.Curr Med Chem，2010，17(25):2764-74.

［5］Cenci M A，Ohlin K E.Rodent models of treatment-induced motor complications in Parkinson’s disease［J］.Parkinsonism Relat Disord，2009，15(Suppl 4):S13-7.

［6］Fu A，Zhou Q，Hui E K，et al.Intravenous treatment of experimental Parkinson’s disease in the mouse with an IgG-GDNF fusion protein that penetrates the blood-brain barrier［J］.Brain Res，2010，1352:208-13.

［7］Zhang Y，Pardridge W M.Near complete rescue of experimental Parkinson’s disease with intravenous non-viral GDNF gene therapy［J］.Pharm Res，2009，26(5):1059-63.

［8］Khan H A.Analytical characterization of a sensitive radioassay for tyrosine hydroxylase activity in rodent striatum［J］.Neurochem Res，2004，29(8):1467-72.