苗艷麗，方富永，紀曉德，宋文東

（廣東海洋大學,廣東 湛江 524088）

牡蠣肉雙酶復合水解和酸水解工藝

苗艷麗，方富永，紀曉德，宋文東*

（廣東海洋大學,廣東 湛江 524088）

以牡蠣肉為原料，采用中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶同時水解技術(shù)和酸水解的方法，對牡蠣肉進行水解，通過對水解條件的研究確定雙酶酶解的條件為：在料水比1:8(g/mL)、pH7.0、溫度50℃的條件下，先用中性蛋白酶（每克原料）2.3×10-5Kat水解4 h；然后依次用菠蘿蛋白酶（每克原料）1.7×10-4Kat連續(xù)水解4 h。氨基酸分析結(jié)果表明：牡蠣肉中含有17種氨基酸，其中包括人體必需的7種氨基酸。

牡蠣；酸水解；酶法水解；氨基酸

牡蠣（Oysters）是一種海產(chǎn)軟體動物,瓣鰓綱,牡礪科[1]。全世界瀕海各國幾乎都有盛產(chǎn)，在我國沿海地區(qū)均有生長，目前已發(fā)現(xiàn)牡蠣有100多種，中國沿海所產(chǎn)的牡蠣約有20多種，作為主要的養(yǎng)殖種類有近江牡蠣、褶皺牡蠣、長牡蠣、大連灣牡蠣和密鱗牡蠣等。牡蠣肉味鮮美,營養(yǎng)豐富,有“海中牛奶”之稱[2]。牡蠣肉質(zhì)乳白、細嫩、營養(yǎng)豐富，除含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和糖類等營養(yǎng)成分外，還含有人體必需的10多種氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，是我國首批列為藥食同源的保健療效食品之一[3-4]。牡蠣作為一種優(yōu)質(zhì)的海產(chǎn)養(yǎng)殖貝類,不僅具有很高的食用價值,而且還具有獨特的保健功能。

目前，國內(nèi)有關牡蠣營養(yǎng)成分的研究較多，但關于牡蠣酶解工藝的研究僅局限于單酶的水解[5-12]，有關其雙酶法水解的研究僅有王亮[13]、吳文龍[14]等報道；有關牡蠣酸水解的研究鮮見報道。因此，本文以牡蠣肉為原料，先用乙酸乙酯除去其中的脂肪，采用雙酶復合水解和酸水解2種方法水解牡蠣肉；再分析水解后所得氨基酸的組成與含量,為今后牡蠣深加工和綜合利用提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

新鮮牡蠣：近江牡蠣,學名Ostrea rivularis Gould，牡蠣科，市售。菠蘿蛋白酶1.1×10-3Kat/g，中性蛋白酶1.3×10-3Kat/g：食品級，廣西龐博生物工程有限公司；其余化學試劑均為市售、分析純。

1.2 主要儀器

DS-1型高效組織搗碎機：上海標本模型廠；TDL-40B臺型式離心機：上海安亭科學儀器廠；LLC-20AT高效液相色譜儀：日本島津出廠；835型氨基酸自動分析儀：日本日立公司；PHS-3C型精密pH計:上海精密科學儀器有限公司；DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋:天津市泰斯特儀器有限公司；HANGPING-FA110型電子天平：上海天平儀器廠。

2 方法

2.1 原材料

新鮮牡蠣，開殼后取肉，牡蠣肉洗凈、勻漿，將其保存于-20℃冰箱內(nèi)，備用。

2.2 牡蠣肉的前處理

先將鮮牡蠣肉用組織搗碎機打成漿狀，用4000 r/min離心10 min，準確稱取6份肉漿。其中1份烘干后稱重，用索氏抽提法測定脂肪含量。其余5份各加入 3 倍量的乙酸乙酯分別攪拌 2、4、6、8、10 h 后，去除脂肪，105℃烘干稱重，再分別用索氏抽提法測定殘留脂肪含量。

2.3 酶解工藝過程

2.3.1 酶解過程

依據(jù)不同蛋白酶的特點及文獻，選擇菠蘿蛋白酶[5]和中性蛋白酶[7]水解牡礪肉。將牡蠣肉洗凈后用組織搗碎機搗成勻漿，按照實驗條件除去脂肪。取一定量的牡蠣肉勻漿按比例加蒸餾水，加入適量蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，在合適條件下恒溫水解，水解結(jié)束后，滅酶。酶解液以4800 r/min離心20 min，取上清液為水解液。取少量水解液測定水解度和氨基酸含量。

2.3.2 指標測定方法

總氮含量測定：采用凱氏定氮法[15]；氨基氮測定：甲醛滴定法[16]；水解度的測定：水解度（DH，%）=水解液氨基氮量×100/總氮量。

2.4 酸水解過程

2.4.1 酸水解液的制備

取30 g牡蠣肉漿，按照實驗條件除去脂肪。加60 mL水煮沸，使蛋白變性；加入計算量的濃鹽酸使其成為濃度6 mol/L的混合液；加熱回流13h，把反應液濃縮除酸；濃縮到50 mL，混合液調(diào)pH到7.0，待測定氨基酸種類含量。

2.4.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA 柱，4.6×150 mm,粒度5 μm。流動相A：磷酸鹽緩沖液（含4%DMF）。流動相B：乙腈（含 4%DMF）。進樣量：20 μL；柱溫：20℃；流速：1 mL/min；檢測波長：436 nm；梯度洗脫程序：B 10%→22%（0～5 min），B 20%→35%（5min～16 min），B 35%→46%（16 min～27 min），B 46%→70%（27 min～28 min），B 70%持續(xù)到 45 min結(jié)束。

3 結(jié)果與分析

3.1 牡蠣肉的前處理

原料中的脂肪在高溫以及反應時間長的情況下會與HCl反應生成致癌物質(zhì)氯丙醇，氯丙醇一旦生成就很難除去。如果先除去原料中的脂肪再用濃HCl水解可以避免氯丙醇的生成。再用索氏抽提法測定鮮牡蠣肉的脂肪含量，按照實驗方法所訴條件，對牡蠣肉進行除脂，結(jié)果見表1。

表1 時間對除脂效果的影響Table 1 The effect of time on degree of eliminating fat

由表1可知，用乙酸乙酯除脂肪2 h，牡蠣肉中的5.49%脂肪能被除去，當攪拌時間分別為4、6、8 h，除去脂肪的含量依次比前個時間段相差為0.86%、0.59%、1.38%，說明隨著時間的延長，可以除去更多牡蠣肉中的脂肪。但當攪拌時間延長到10 h的時候，與8 h相差僅0.14%，脂肪的含量變化很小，因此攪拌8 h用乙酸乙酯除脂的效果最好。

3.2 中性蛋白酶酶解條件對水解反應的影響

研究了酶用量（以每克原料計）、酶解溫度、酶解時間、料水比對水解反應的影響，結(jié)果見表2。

表2 中性蛋白酶酶解條件對水解反應的影響Table 2 The effect of neutral protease on degree of hydrolysis

由表2數(shù)據(jù)可知，酶用量（每克原料）增加到2.3×10-5Kat時，水解度上升到38.23%，增加到4.7×10-5Kat時，水解度增加較小，只達到40.87%，增加趨勢不明顯。為了使牡蠣水解較徹底，又不增加苦味，適當控制水解度。因此，酶用量選2.3×10-5Kat/g。酶解時間越長，水解度越大。時間選擇上，雖然6 h的水解度最高，但是時間越長，蒸發(fā)水分越多，水解液顏色越深、較混濁。水解4 h的顏色居中，水解度也較高。雖然料水比1:10（g/mL）時水解度最高，但濃縮時耗能過大。因此選擇1:8（g/mL）的料水比做為最適加水比。木瓜蛋白酶可以在較高的溫度下作用，巴非蛤肉水解的溫度為50℃時水解度最高，因此在溫度選擇上選擇50℃。

由表2數(shù)據(jù)分析可得，中性蛋白酶水解最適水解工藝條件為：pH7.0、溫度 50 ℃、酶用量 2.3×10-5Kat/g、料水比 1:8（g/mL）、時間 4 h；此時水解度為 39.56%。

3.3 2種不同酶的復合水解實驗

取牡蠣肉漿5 g，加中性蛋白酶在酶用量為2.3×10-5Kat/g、料水比 1:8（g/mL）、pH7.0、溫度 50 ℃條件下，酶解4 h，水解完成后滅活酶活性；再依次加菠蘿蛋白酶1.7×10-4Kat/g繼續(xù)水解4 h，其他條件同上，水解完成后滅活酶活性，標記為水解液I。在4800 r/min條件下離心20 min，用少量活性炭脫色后，調(diào)pH為7后測其水解度為43.22%和其中氨基酸的含量待測。

3.4 牡蠣肉水解液中游離氨基酸含量分析

牡蠣肉的雙酶水解液I和酸水解液（標記為II）經(jīng)過離心和超濾后用氨基酸分析儀測定其游離氨基酸含量，結(jié)果如表3所示。

表3 牡蠣肉不同的水解液中氨基酸含量比較Table 3 The contents of free amino acid in hydrolysates of Oyster meat μg/mL

由表3可見：該種牡蠣肉水解液中含有17種氨基酸，包括人體必需的7種氨基酸，其中賴氨酸和蘇氨酸產(chǎn)生峰重疊，未能測出各自的含量。由表3中對比可知，水解液II比I中17種游離氨基酸的含量有很大的提高，均有20%～50%的增加，蛋白質(zhì)水解的較為徹底。水解液I中的游離氨基酸含量達到300.63 μg/mL，其中7種必需氨基酸139.15 μg/mL，占46.3%。水解液II中的游離氨基酸含量達到567.82 μg/mL，其中7種必需氨基酸153.09 μg/mL，占26.9%。由此可見，用中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶同時水解技術(shù)，所得水解液中的必需氨基酸的相對含量是酸水解液中的2倍。水解液I中天冬氨酸（鮮味）、谷氨酸（鮮味）、丙氨酸（甜味）和甘氨酸（甜味）這4種風味氨基酸含量為117.37μg/mL，占總氨基酸含量的39.0%，水解液II中的含量則分別為321.85 μg/mL，占總氨基酸含量的56.7%。因此，酸水解液（水解液II）中風味氨基酸的含量比水解液I中高。

酸水解蛋白質(zhì)原料，在水解過程中，除色氨酸外其它氨基酸均不被破壞，加之蛋白質(zhì)水解率高，生產(chǎn)周期短，且工藝較為成熟，因此采用較為溫和的酸解條件，在盡量減低氯丙醇的產(chǎn)生同時能充分利用原料達到水解的目的。單酶水解法得到的產(chǎn)物具有水解不徹底，部分水解的中間產(chǎn)物（短肽）為主要成分，游離氨基酸含量很少。復合酶具有水解較徹底，小肽（特別是二肽）為主要成分，游離氨基酸含量較多，部分水解的中間產(chǎn)物短肽含量很低，較有利于消化吸收。為獲得較高的水解度，采用同時加入中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶同時水解技術(shù)，可提高牡蠣肉的水解效果和縮短水解時間，降低生產(chǎn)成本。

3 結(jié)論

以水解率為指標，兼顧水解液的口感、外觀和氨基酸含量、生產(chǎn)成本，選擇雙酶法和酸水解法對牡蠣肉進行水解。通過對水解條件的研究發(fā)現(xiàn)最適的酶解條件為：在料水比 1:8（g/mL）、pH7.0、溫度 50 ℃條件下，用中性蛋白酶2.3×10-5Kat/g，先水解4 h；水解完成后滅活酶；再依次加菠蘿蛋白酶（每克原料）1.7×10-4Kat分別繼續(xù)水解4 h，其他條件同上。

牡蠣肉水解液氨基酸分析結(jié)果表明，牡蠣肉中氨基酸含量豐富，包括人體必需的7種氨基酸。水解液I中7種必需氨基酸含量比水解液II中的高，占總氨基酸含量的46.3%。水解液II中的風味氨基酸含量比水解液I中高，占總氨基酸含量的56.7%。

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The Hydrolysis of Oyster Meat with Two Kinds of Proteinase and Using HCl

MIAO Yan-li，F(xiàn)ANG Fu-yong,JI Xiao-de，SONG Wen-dong*
（Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,Guangdong,China）

Oyster meat was hydrolyzed to prepare amino acid hydrolysate using neutral protease and pineapple protease simultaneously and using HCl,respectively.The results showed that the optimum conditions of enzymatic hydrolysis were as follows:the temperature was 50℃,pH was 7.0,the amount of enzyme was 2.3×10-5Kat/g,expects the hydraulic modulus was 1:8,the time was 4 h.After 4 h hydrolysis of neutral,pineapple protease were used by step for 4 h respectively.The result indicated that seventeen kinds of amino acids were detected,which included seven essential amino acids in humans.

Oysters;acid hydrolysis;enzymatic hydrolysis；amino acids

廣東省科技計劃項目（93043）

苗艷麗（1978—），女（漢），講師，碩士，主要從事應用化學方面的研究。

*通信作者：宋文東（1960—），男，教授，博士，主要從事食品方面的研究。

2010-08-24