王玉，鄭學(xué)雙，畢玉婷，吳婧波，田偉，張亞雄

（三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院生物工程重點實驗室，湖北 宜昌 443002）

蟲草保健糖的制備

王玉，鄭學(xué)雙，畢玉婷，吳婧波，田偉，張亞雄*

（三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院生物工程重點實驗室，湖北 宜昌 443002）

研究培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基配方等因素對冬蟲夏草菌絲生長和產(chǎn)糖的影響，得出最佳培養(yǎng)時間為60 h～70 h，培養(yǎng)基配方為蔗糖5%、酵母抽提物2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、CaCl20.02%、ZnSO40.01%，蟲草菌絲體平均得率可以達(dá)到1.76%，且發(fā)酵液胞外多糖的含量可達(dá)5930.6 mg/L。結(jié)合感官指標(biāo)和營養(yǎng)指標(biāo)，蟲草保健糖最佳配方為砂糖和淀粉漿比例（g/mL）為75～80∶25～2，蟲草多糖的添加量為0.1%。160℃高溫熬制，80℃～90℃冷卻制得的蟲草保健糖口感醇正、體態(tài)均勻、色澤明亮、氣味宜人。

液體深層發(fā)酵；北蟲草菌絲體；保健糖

冬蟲夏草是一種平補陰陽的名貴藥材，主要成分為蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸、氨基酸等，與人參、鹿茸并列為三大補品，具有滋肺益氣、生血化痰等功效。蟲草菌體內(nèi)積蓄有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和特有的高原生物成分，是天然的高效免疫調(diào)節(jié)劑，不僅能增強人體的免疫力，而且對免疫狀態(tài)亢進(jìn)者能產(chǎn)生適當(dāng)?shù)囊种谱饔茫⑶宜鼘Ψ窝浊蚓?、鏈球菌、金黃色葡萄球菌等數(shù)10種病原菌均有抑制作用。一年四季均可進(jìn)補，且補而不燥。因天然冬蟲夏草有嚴(yán)格的寄生性和特殊的地理環(huán)境，故產(chǎn)量有限，采集不易。近年來，野生資源不斷減少，需求不斷增加，為解決供求矛盾現(xiàn)多用蟲草菌絲體代替天然蟲草[1]，早在20世紀(jì)70年代后期，四川省中藥研究所成功地對蟲草進(jìn)行了組織分離、培養(yǎng)，并進(jìn)行了一系列的成分測定，證實了人工冬蟲夏草游離氨基酸的種類和含量都較天然蟲草為高[2]。目前市場上的蟲草保健品多以膠囊的形式存在，服用不方便而且不適合兒童食用，這在一定程度上局限的蟲草的應(yīng)用范圍。本實驗利用易于掌握的液體深層發(fā)酵方式培養(yǎng)蟲草菌絲體不僅大大緩解藥源不足的問題，而且將其營養(yǎng)成分制成保健糖的形式，美味可口，食用方便，適應(yīng)面更廣，有較好的市場開發(fā)價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

實驗室保藏的北冬蟲夏草菌(Cordyceps militaris)。

1.1.2 斜面和種子培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基（%）

蔗糖5%、酵母抽提物2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、CaCl20.02%、ZnSO40.01%。pH自然，121℃、0.1 MPa下滅菌30 min。

1.2 蟲草菌絲體的制備

1.2.1 蟲草菌絲體的制備工藝流程

菌種試管培養(yǎng)→液體種子培養(yǎng)→液體深層培養(yǎng)→干燥濃縮→蟲草菌絲體

1.2.2 斜面母種培養(yǎng)

20 °C下培養(yǎng)7 d。

1.2.3 液體種子培養(yǎng)

在超凈工作臺上向種子培養(yǎng)基中加入母種斜面菌絲，置于20℃搖床培養(yǎng)（110 r/min）。

1.2.4 液體發(fā)酵培養(yǎng)

500 mL三角瓶裝200 mL發(fā)酵液，20℃，搖床培養(yǎng)（110 r/min）。

1.2.5 低溫干燥及粉碎

用32層紗布過濾發(fā)酵液，將發(fā)酵液與菌絲體分離，并用無菌水淋洗菌絲體。將濕的菌絲體均勻涂在干燥網(wǎng)上，放入干燥箱中，風(fēng)量控制在最大，溫度控制在65℃，干燥至水分在8%以下，放入粉碎機(jī)粉碎，60目過篩。

1.2.6 過程控制

鏡檢：選取合適的培養(yǎng)基，分別挑取適量菌絲和菌液制成片，用結(jié)晶紫進(jìn)行簡單染色后在顯微鏡下進(jìn)行觀察，并且記錄觀察結(jié)果，用顯微照相。

還原糖的測定：DNS法；氨基態(tài)氮的測定：甲醛滴定法。

菌絲體得率/%=[菌絲體干重（kg）/發(fā)酵液的體積(L)]×100。

1.3 蟲草多糖的提取

1.3.1 蟲草多糖的提取工藝流程

菌懸液濃縮醇沉→抽濾得濾液→Sevag法對粗多糖溶液進(jìn)行脫蛋白處理→離心得上清液

1.3.2 發(fā)酵液的濃縮[3]

用32層紗布過濾發(fā)酵液，將濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的燒瓶中，待濾液濃縮至原體積的1/5時，用3倍于新濾液體積的95%的乙醇醇沉12 h，抽濾得沉淀，將沉淀溶于80 mL熱水中，靜置。抽濾得濾液。

1.3.3 提取胞外多糖[4]

配制質(zhì)量濃度為1%的粗多糖溶液。按體積比1/0.24加入樣品及氯仿正丁醇混合液其中氯仿和正丁醇體積比為1∶0.2，振搖30 min。離心取上清液。重復(fù)以上操作5次。

1.4 蟲草保健糖的制備

蟲草保健糖的制備工藝流程：砂糖、淀粉糖漿、其他輔料→混合融化→過濾→熬煮→預(yù)冷→調(diào)配→成型→冷卻→包裝→檢驗→成品。

1.5 蟲草保健糖的評定

1.5.1 蟲草保健糖的評定標(biāo)準(zhǔn)

由嗅覺靈敏的5名實驗人員組成評定小組，進(jìn)行品嘗后對保健糖進(jìn)行評定。其中評定標(biāo)準(zhǔn)見表1、表2。

表 1 蟲草保健糖感官評分參考標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The sense scoring criteria of Cordyceps health sugar

表 2 蟲草保健糖保健功能評分參考標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The function scoring criteria of Cordyceps health sugar

1.5.2 微生物標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)菌總數(shù)≤100個/mL，大腸桿菌≤3個/100 mL，致病菌不得檢出。

2 結(jié)果與討論

2.1 北冬蟲夏草液體培養(yǎng)條件及原料的選擇

1）以時間為參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)條件的選擇，結(jié)果表明：20℃、pH 7，發(fā)酵時間應(yīng)該控制在60 h～70 h為宜，此階段得到的菌絲體最多，蟲草菌絲的平均得率可以達(dá)到1.76%以上且發(fā)酵液胞外多糖的含量可達(dá)5930.6 mg/L。時間過長易出現(xiàn)菌絲體自溶現(xiàn)象，增加發(fā)酵液的稠度，加大采收菌絲體的難度，影響收率。

2）在上述條件下進(jìn)行了培養(yǎng)基配方的正交試驗，以蔗糖、酵母抽提物、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、ZnSO4作三水平試驗，得出蔗糖5%、酵母抽提物2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、CaCl20.02%、ZnSO40.01%所獲得的菌絲體和發(fā)酵混合液感官指標(biāo)都適合蟲草保健糖的制備。

2.2 蟲草保健糖糖配方的確定

2.2.1 蟲草多糖添加量的確定

由于蟲草多糖來自發(fā)酵液，添加量不合適時會導(dǎo)致制得的蟲草保健糖帶有腥味，影響風(fēng)味，但蟲草多糖含量過低時影響糖的保健功能。本實驗分別設(shè)蟲草保健糖含量0.5%、0.15%、0.1%、0.05%4個水平，選嗅覺靈敏的5名實驗人員組成評定小組，進(jìn)行品嘗后根據(jù)表1和表2的評分標(biāo)準(zhǔn)對保健糖進(jìn)行評定。確定最優(yōu)用量后，高溫熬煮時加入。蟲草多糖添加量實驗結(jié)果見表3。

表 3 蟲草多糖添加量實驗結(jié)果Table 3 The result of adding Cordyceps polysaccharides

由表3可知，確定當(dāng)蟲草多糖的添加量為0.1%時制得的蟲草保健糖風(fēng)味純正，營養(yǎng)價值高。

2.2.2 配料添加量的確定

根據(jù)數(shù)十次的試驗結(jié)果，當(dāng)蟲草保健糖中砂糖和淀粉漿比例（g/mL）是75～80∶25～2時易于成型。另外，在其中添加適量的VC可以改善口感及防止?fàn)I養(yǎng)成分的氧化。

2.3 蟲草保健糖的制備工藝控制

160℃左右高溫熬制砂糖與淀粉糖漿，所得的糖膏白糖濃度很高，含水分極小且糖均勻、色度好，當(dāng)糖膏溫度下降至100℃以下時，控制冷卻速度使冷卻終點溫度不低于80℃～90℃，糖膏的成型效果最好。

3 結(jié)論

20℃、pH7，最佳發(fā)酵時間為60 h～70 h，最佳培養(yǎng)基配方為：蔗糖5%、酵母抽提物2%、KH2PO40.1%MgSO40.05%、CaCl20.02%、ZnSO40.01%，蟲草菌絲體平均得率可以達(dá)到1.76%以上且發(fā)酵液胞外多糖的含量可達(dá)5930.6 mg/L，所獲得的菌絲體和發(fā)酵混合液感色澤香氣等官指標(biāo)都適合蟲草保健糖的制備。蟲草保健糖最佳配方：砂糖和淀粉漿比例（g/mL）為75～80∶25～2、蟲草多糖的添加量為0.1%。160℃左右高溫熬制砂糖與淀粉糖漿，所得的糖膏白糖濃度很高，含水分極小且糖均勻、色度好，控制冷卻終點不低于80℃～90℃，制得的蟲草保健糖口感醇正，體態(tài)均勻，外觀新穎，色澤明亮，氣味宜人，不添加任何的防腐劑和穩(wěn)定劑，更有名貴藥材-冬蟲夏草中的營養(yǎng)成分，是一種純天然的食品。另外，該制作工藝簡單，易于控制，成本合理，適合企業(yè)作大規(guī)模化的推廣。

[1]李樹立，李娜，張光一，等，蟲草薏米糊的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2007(5):183-189

[2]丁鼎樂.打響冬蟲夏草的研發(fā)戰(zhàn) [N].醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報，2007-01-03(004)

[3]孫悅迎，張旭東，雷萍.冬蟲夏草菌絲多糖分離提取特性研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2003,31(5)：36-37

[4]范衛(wèi)強，尹鴻萍，周長林.蟲草多糖的分離、純化和初步藥效活性研究[J].生物加工過程,2008(1)：69-73

Preparation of Cordyceps Health Sugar

WANG Yu，ZHENG Xue－shuang，BI Yu－ting，WU Jing－bo，TIAN Wei，ZHANG Ya－xiong*
（Key Laboratory of Biological Engineering of Chemistry and Life Science College，China Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China）

The effects of culture time,liquid medium on the biomass and the polysaccharides production of Cordyceps sinensis were studied,the results showed that the optimum culture time was 60 h-70 h and the optimum liquid medium was sugar 5%，yeast extract 2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，CaCl20.02%，ZnSO40.01%，the average output of biomass could reach 1.76%and the maximum output of the polysaccharides could reach 5930.6 mg/L.Orthogonal and nutritional tests were used to evaluate the character of the sugar，the results showed that the optimum formula was the ratio of sugar and starch syrup （g/mL）75-80∶25-2，the added quantities of Cordyceps polysaccharides 0.1%.When stewed temperature was 160℃high，cooling temperature was 80℃-90℃，the Cordyceps health sugar had purified taste，well－proportioned body，luster and bright color as well as pleasant odors.

submerged fermentation；Cordyceps sinensis；health sugar

王玉（1990—），女（漢），本科，研究方向：食品發(fā)酵工程。

*通信作者:張亞雄，女，教授，博士，主要從事微生物方向的研究。

2011-03-11