喬鏡澄，張同存，姜悅，路福平

（1.天津天獅學院 生物工程學院，天津 301700；2.天津科技大學 生物工程學院，天津 300222）

基于對細胞體外受氧脅迫的抗氧化的反應的研究，已發(fā)現(xiàn)氧自由基可以導致細胞結構和功能的損傷，最終導致細胞的死亡。其中脂質過氧化就是氧脅迫的產物。然而，在細胞內的抗氧化作用的反應機理仍不清楚[1]。

破囊壺菌的重要合成產物角鯊烯，角鯊烯（squalene）[2-3]：化學命名為2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22.二十四碳六烯，是一種長鏈三萜類化合物，別名為鯊烯、三十碳六烯、角鮫油素或魚肝油萜，屬于不飽和脂質，它是所有類固醇合成的前體物質。鯊烯是天然抗氧化劑，可以保護細胞免遭自由基的損害并且可以增強細胞的免疫系統(tǒng)。鯊烯的特殊性質使其應用范圍非常廣泛，這種無毒性的物質可以直接添加到普通食品中，添加鯊烯和不飽和脂肪酸的功能性食品也在積極的研制中。

已有研究報道[4]，在細胞外部鯊烯可以防止不飽和脂肪酸的過氧化反應。然而，在細胞內的抗氧化作用的機制仍然不清楚。已有報道[1]雙氧水是細胞內脂肪酸過氧化反應的主要誘導劑，Cumeme hydroperoxide（CHP）t-Butylhydroperoxide可以引發(fā)小鼠肝細胞內的脂肪酸產生過氧化現(xiàn)象，茉莉酸甲酯也是常用的引起脂肪酸過氧化現(xiàn)象的誘導劑[5]。

本研究選用上述4種常用的脂質過氧化誘導劑作用于破囊壺菌引發(fā)細胞內脂質過氧化反應。通過測定MDA的含量反映細胞內脂質過氧化的程度，也間接反映出細胞受到ROS攻擊后的損傷程度[6]，因此在本實驗中選用這一指標，觀察細胞內在外界氧脅迫下抗氧化的反應。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

破囊壺菌（Thraustochytrid）Aurantiochytriumsp.BRMP4-A1，香港浸會大學理學院生物系微藻研究實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基組成（1 L）[7]：MnCl28.6 mg/L，F(xiàn)eCl32.9 mg/L，ZnCl20.6 mg/L，CoCl2·6H2O 0.28 mg/L，CuSO4·5H2O 0.02 mg/L，硼酸 34.2 mg/L，Na2EDTA 30 mg/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KCl 1 g/L，（NH4）2SO40.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.3 g/L，KH2PO40.3g/L，NaHCO31g/L，葡萄糖30g/L，NaCl 25g/L，谷氨酸鈉 2 g/L，Yeast Extract 2 g/L，蒸餾水定容至1 L。

配制好后，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調節(jié)pH為6.0，然后高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為：121℃，20min。

1.1.3 試劑

雙氧水，t-Butyl htdroperoxid：美國sigma公司，茉莉酸甲酯：美國sigma公司，Cumeme hydroperoxide：美國sigma公司，其他試劑為化學純或分析純。

1.1.4 儀器和設備

HS-200B恒溫培養(yǎng)搖床：上海和呈儀器制造有限公司；HV-50高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；JY98-III超聲波間歇破碎儀：寧波新芝儀器研究所；VLT1386-3-V34超低溫冰箱：美國REVCO公司；Allegra X-22臺式高速離心機：美國貝克曼。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

菌種培養(yǎng)：挑取一環(huán)接種到裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，200 r/min，25℃恒溫，黑暗條件下培養(yǎng)48 h。

菌體發(fā)酵：以5%的接種量接種種子液到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，200 r/min，25℃恒溫，黑暗條件下培養(yǎng)36 h。

1.2.2 樣品中丙二醛濃度的測定

按照丙二醛測定試劑盒操作步驟進行加樣。旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷卻，然后3500 r/min～4000 r/min，離心10 min，取上清在OD532nm處，1 cm光徑，蒸餾水調零，測定樣品的吸光度值。

1.2.3 細胞存活率測定方法

稀釋平板計數法：菌液混合均勻后，無菌條件下，吸取1 mL菌液，移入裝有9 mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，進行10倍系列梯度稀釋，吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液500 mL到無菌培養(yǎng)皿中，再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻，每個稀釋度用一個滅菌刮鏟，將涂布好的平板平放于桌上20 min～30 min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內，然后將平板倒轉，室溫黑暗培養(yǎng)，至長出單菌落后即可計數。

1.2.4 菌體干重測定方法

將GC-50濾紙105℃烘干，放入干燥箱中冷卻至重量恒定，稱重備用。在通風櫥中用移液管吸取5 mL菌液，抽濾到已烘干的濾紙上，105℃烘干，隔夜，冷卻后稱其重量。根據2個重量差及菌體量計算菌體干重。

2 結果與討論

2.1 雙氧水誘導的脂過氧化反應

細胞培養(yǎng)到36 h時，加入雙氧水，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定細胞內MDA含量，結果如表1所示。

表1 36 h時雙氧水對細胞生長的影響和脂過氧化作用Table 1 Effect of H2O2on cell number and lipid peroxidation（MDA value）at 36 h

在菌體細胞發(fā)酵培養(yǎng)0 h時，加入雙氧水，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細胞，測定細胞內MDA值，細胞干重及細胞存活率，結果如表2所示。

表2 0 h時加入雙氧水對細胞干重的影響和脂過氧化作用Table 2 Effects of H2O2on cell dry weight（DW），cell number and MDA value at 0 h

由表1、表2所示，36 h時加入脂質過氧化誘導劑，隨著雙氧水濃度的增加MDA值呈現(xiàn)下降趨勢，當雙氧水終濃度達到當5000 μmol/L時，MDA值明顯低于空白對照組。同時，細胞存活率隨著雙氧水的濃度增加而降低。雙氧水濃度達到1000 μmol/L和5000 μmol/L時，細胞數僅為104個/mL。在細胞培養(yǎng)0 h時，加入雙氧水，MDA值仍然沒有明顯上升，只有在雙氧水濃度為500 μmol/L時，MDA值接近空白對照組。而隨著雙氧水濃度的增加，細胞干重與細胞數都呈現(xiàn)下降趨勢，即細胞存活率隨著雙氧水濃度的增加而降低。

2.2 t-butyl hydroperoxide誘發(fā)的脂過氧化反應

將t-butyl hydroperoxide加入到培養(yǎng)36 h的細胞進行誘導脂質過氧化的實驗，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定細胞內MDA含量，結果如表3所示。

表 3 36 h 時加入 t－butyl hydroperoxide（t－BuOOH）對細胞存活的影響和脂質過氧化作用Table 3 Effect of t-butyl hydroperoxide（t－BuOOH）on cell viability and MDA value at 36 h

在菌體細胞發(fā)酵培養(yǎng)0 h時，加入t-Butyl hydroperoxide，繼續(xù)培養(yǎng)至36 h，收集細胞，測定細胞內MDA值，細胞干重及細胞存活率，結果如表4所示。

表4 0 h時加入t-Butyl hydroperoxide對細胞生長的影響和脂過氧化作用Table 4 Effects of t-Butyl hydroperoxide on cell number and lipid peroxidation（MDA value）at 0 h

由表3、表4所示，36 h時加入脂質過氧化誘導劑MDA值沒有隨著t-Butyl hydroperoxide濃度的增加而提高，相反呈現(xiàn)下降趨勢，并且均明顯低于空白對照組，而通過平板計數可知，高濃度的t-Butyl hydroperoxide對細胞作用較大，當其濃度達到1000 μmol/L時，細胞數為零，細胞生長完全被抑制。細胞培養(yǎng)0 h時，加入脂質過氧化誘導劑，t-Butyl hydroperoxide在較高濃度下，細胞存活率很低，甚至死亡，0 h時，細胞內抗氧化物質積累量較少，因此在高濃度的t-Butyl hydroperoxide作用下，對細胞造成毒害作用，導致細胞死亡。加入這種脂過氧化誘導劑后，MDA值沒有上升，均明顯低于空白對照組。

2.3 茉莉酮酸甲酯誘導的脂過氧化反應

將茉莉酮酸甲酯加入到培養(yǎng)36 h的細胞中，進行脂質過氧化誘導，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定細胞內MDA含量，結果如表5所示。

表5 36 h時加入茉莉酮酸甲酯對細胞生長的影響和脂過氧化作用Table 5 Effects of Methyl jasmonate on cell growth and MDA value at 36 h

由表5所示，在各濃度茉莉酸甲酯的作用下，MDA值都低于空白對照組，茉莉酮酸甲酯對細胞的生長并沒有抑制作用，細胞數沒有影響。

2.4 cumeme hydroperoxide（CHP）誘導的脂過氧化反應

將培養(yǎng)到36 h的細胞加入CHP進行脂質過氧化誘導，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測定細胞內MDA含量及細胞數，結果如表6所示。

由表6所示，只有當cumeme hydroperoxide濃度達到100 μmol/L 時，MDA值略高于空白對照（527.1）為562.5，在所選用的CHP的濃度范圍內，細胞的生長并沒有受到抑制，由此可以得出，CHP對于細胞的生長沒有毒害作用。

表6 36 h時加入cumeme hydroperoxide對細胞生長的影響和脂質過氧化作用Table 6 Effect of cumeme hydroperoxide on cell number and MDA value at 36 h

在菌體細胞發(fā)酵培養(yǎng)0 h時，加入cumeme hydroperoxide，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細胞，測定細胞內MDA值，細胞干重及細胞存活率，結果如表7所示。

表7 0 h時加入cumeme hydroperoxide對細胞生長和脂過氧化作用Table 7 Effect of cumeme hydroperoxide on cell number and MDA value at 0 h

由表7所示，高濃度的CHP仍然未能誘導脂過氧化反應，MDA值均明顯低于空白對照組，但是在較高濃度CHP作用下，細胞數下降，細胞存活率降低。

3 結論

本研究選用H2O2、t-Butyl hydroperoxide、茉莉酸酮甲酯和CHP 4種常用的脂質過氧化誘導劑處理BRMP4-A1菌株細胞[8-10]，并考察細胞脂質過氧化反應程度，結果表明：在整個實驗過程中，都沒有看到MDA值的明顯升高。同時，已有研究證明[7]，該菌株在細胞培養(yǎng)至36 h時，細胞內積累鯊烯量達到最大值，因此，認為正是破囊壺菌合成的鯊烯可以保護不飽和脂肪酸發(fā)生自發(fā)氧化現(xiàn)象，它較強的抗氧化作用可以減少自由基的生成，而鯊烯本身清除了氧自由基，在這樣的多重作用下，強有力的遏制了過氧化物造成的細胞內部的脂質過氧化的損失，也抑制了脂質過氧化。所以本實驗可以看到MDA的含量均明顯低于空白對照組。當CHP濃度達到100 μmol/L時，MDA值高于空白對照，引發(fā)細胞內的脂過氧化，而細胞存活率未受到影響，這種情況表明，很大可能是鯊烯的抗氧化性保護細胞免受自由基的侵害，減小了細胞受損傷程度，這也仍需進一步的驗證。

當細胞培養(yǎng)0 h時，未出現(xiàn)MDA高于空白對照組想象，但是在高濃度的誘導劑作用下，細胞出現(xiàn)了死亡，這一結果表明：0 h時，細胞內代謝物的積累為0，高濃度的氧化劑t-Butyl hydroperoxide在發(fā)酵初期就導致細胞的大量死亡，不能合成鯊烯。因此，得出t-Butyl hydroperoxide對破囊壺菌細胞有毒害作用，高濃度作用下會導致破囊壺菌的死亡[11]。隨著作用時間的增加，在破囊壺菌細胞內部，鯊烯逐漸積累，低濃度的t-Butyl hydroperoxide和茉莉酮酸甲酯沒有誘導脂過氧化，所以脂過氧化并不是導致破囊壺菌細胞死亡的主要原因。細胞死亡是由于高濃度的t-Butyl hydroperoxide作用下而導致的。

可以確定在破囊壺菌的代謝產物中的確存在具有抗氧化作用的物質，并且角鯊烯在細胞內部已發(fā)揮作用能夠抵抗脂質過氧化并且保護細胞免受外界侵害。

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