叢 喆，劉 浩，朵建英，王 衛(wèi)，蔣 虹，高 虹，楊志偉，Sylvain Fleury，魏 強(qiáng)，秦 川

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.Mymetics Corporation，CH 1066 Epalinges，Switzerland)

B亞型SHIVSF162p3中國(guó)恒河猴小劑量多次陰道黏膜感染

叢 喆1，劉 浩1，朵建英1，王 衛(wèi)1，蔣 虹1，高 虹1，楊志偉1，Sylvain Fleury2，魏 強(qiáng)1，秦 川1

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.Mymetics Corporation，CH 1066 Epalinges，Switzerland)

目的 模擬HIV性傳播感染特點(diǎn)進(jìn)行中國(guó)恒河猴陰道黏膜小劑量多次感染研究，為我國(guó)艾滋病疫苗有效性評(píng)價(jià)提供新的模型構(gòu)建思路。方法 選用20-30TCID50劑量的SHIVSF162p3病毒陰道黏膜途徑感染六只成年雌性中國(guó)恒河猴，共感染13次，每次攻毒間隔4～7 d。采取測(cè)定血漿病毒載量和外周血CD4+∶CD8+。結(jié)果 6只中國(guó)恒河猴經(jīng)13次病毒攻擊后，經(jīng)檢測(cè)均建立系統(tǒng)性感染，血漿病毒載量呈陽性;CD4+∶CD8+均有下降。結(jié)論成功建立了中國(guó)恒河猴陰道黏膜小劑量多次感染模型，為艾滋病研究提供了新的更接近于自然感染狀態(tài)的模型建立模式。

猴-人免疫缺陷病毒(SHIV);模型，動(dòng)物;黏膜感染

近年來，我國(guó)艾滋病流行趨勢(shì)和特點(diǎn)發(fā)生了很大改變。2007年數(shù)據(jù)顯示，性傳播已經(jīng)成為最主要的傳播途徑。嚴(yán)峻的流行形式和流行特點(diǎn)迫切需要研制出安全有效的艾滋病黏膜疫苗。隨著艾滋病感染機(jī)制的深入研究，提倡建立模擬自然感染方式的動(dòng)物模型進(jìn)行候選疫苗的安全性、有效性以及免疫策略評(píng)價(jià)。因此，進(jìn)行模擬HIV性傳播特點(diǎn)的恒河猴黏膜感染研究顯得非常迫切和重要。本文用致病性SHIVSF162p3按小劑量多次感染的方法經(jīng)陰道途徑連續(xù)接種中國(guó)恒河猴，分析感染模型病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及免疫學(xué)等方面的變化特點(diǎn)，為今后利用此黏膜模型進(jìn)行艾滋病早期感染和發(fā)病機(jī)制以及疫苗和殺微生物劑有效性評(píng)價(jià)等研究提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

恒河猴 6 只，實(shí)驗(yàn)編號(hào)分別為 1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6。購(gòu)自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所(一級(jí)動(dòng)物，合格證編號(hào):SCXK(京)2005-0005)，用商品化膨化飼料飼養(yǎng)。體重4～6 kg。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)體檢無異常，經(jīng)血清學(xué)間接免疫熒光抗體檢查法(IFA)檢查排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1、2、5)和猴 T淋巴細(xì)胞性 I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒(SIV)易感性密切相關(guān)的4種基 因 (Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17)篩查結(jié)果為陰性［1］。

1.2 感染毒株

感染毒株為SHIVSF162p3，由美國(guó) NIH提供，中國(guó)恒河猴PBMCs滴定病毒原液 TCID50滴度為1×104TCID50/mL。

1.3 感染方法［2］

將麻醉好的實(shí)驗(yàn)猴放在操作臺(tái)上，動(dòng)物采取俯臥位，后肢抬高，暴露陰道口。用2 mL預(yù)冷的無菌PBS清洗陰道。再將稀釋好的適當(dāng)濃度的病毒液1 mL緩慢推入。實(shí)驗(yàn)猴保持此姿勢(shì)30 min。

1.4 感染劑量和SHIVSF162p3感染猴血樣的采集和處理

感染采取小量多次的方法，共感染13次。前6次使用20TCID50的SHIVSF162p3，后7次使用30TCID50的 SHIVSF162p3，間隔 4 ～ 7 d，即分別在 0、7、11、16、20、23、27、31、37、45、50、57 d 和 64 d 進(jìn)行陰道感染。在每次感染前及13次感染結(jié)束后，即71、85、98、114、126、140、154、168、182、203、217 d 及 246 d采EDTA抗凝血3 mL，分別測(cè)定外周血 CD4+/CD8+比值及血漿病毒載量。

1.5 SHIVSF162p3感染猴血漿病毒載量的測(cè)定［3］

提取EDTA抗凝血漿中病毒 RNA，使用 SYBR green I實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR方法測(cè)定血漿病毒載量。

1.6 SHIVSF162p3感染猴外周血CD4+/CD8+比值及絕對(duì)數(shù)測(cè)定［4］

CD3-PerCP(BD，552851)、CD4-FITC(BD，550628)、CD8-PE(BD，557086)抗體標(biāo)記 EDTA抗凝全血中淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(Calibur FACS)測(cè)定CD4+/CD8+比值。根據(jù) Facs Calibur測(cè)定的CD4+/CD8+比值、血常規(guī)結(jié)果，計(jì)算出 CD4+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 SHIVSF162p3感染猴外周血血漿病毒載量

6只實(shí)驗(yàn)猴都先后出現(xiàn)了血漿病毒載量。1-1感染后27 d出現(xiàn)載量，37 d達(dá)到高峰(6.498×107copies/mL)，57 d載量檢測(cè)陰性消失，但在85 d載量再次出現(xiàn)，直至246 d載量一直都維持在105copies/mL左右。1-2病毒載量出現(xiàn)最早，初次感染后的23 d達(dá)到5.665×105copies/mL，27 d達(dá)到高峰(2.1×107copies/mL)，隨后下降，至57 d檢測(cè)呈陰性，共持續(xù)了4周時(shí)間，并且一直到第246 d都持續(xù)陰性。1-3和1-4的載量變化與2號(hào)相似，只是載量出現(xiàn)時(shí)間稍晚，1-3的載量出現(xiàn)在37 d，高峰期在45 d，也達(dá)到了107copies/mL的水平，但只維持了2周的時(shí)間;1-4比1-2晚4 d出現(xiàn)載量，出現(xiàn)時(shí)載量也已達(dá)到105copies/mL的水平，高峰期出現(xiàn)在31d(4.72×106copies/mL)，維持了3周左右的載量。不同的是，它們分別在感染后154 d和203 d出現(xiàn)一過性小幅反彈，載量水平只在103～104copies/mL之間。1-5和1-6的載量出現(xiàn)最晚，均出現(xiàn)在感染后50 d，并且不連續(xù)，沒有明顯的高峰，始終維持在104～106copies/mL的水平(圖1)。

2.2 SHIVSF162p3感染猴外周血CD4+/CD8+比值

圖1 SHIVSF162p3小劑量多次陰道途徑感染恒河猴血漿病毒載量結(jié)果Fig.1 The viremia(viral RNA copies/mL plasma)in the Chinese-original rhesus macaques infected IVAG with repeated low dose of SHIVSF162p3

6只實(shí)驗(yàn)猴的CD4+/CD8+比值在某一段時(shí)間內(nèi)均有一個(gè)急劇下降的過程，總體有一個(gè)下降的趨勢(shì)。1-1在感染后37 d CD4+/CD8+比值迅速?gòu)母腥竞?1 d的1.51下降到0.50，并且持續(xù)走低，到300 d時(shí)，已降低到0.35。1-2和1-4總體沒有太大的變化，但分別在感染后31 d和37 d有一個(gè)下降過程。1-2由27 d的3.89直降到1.55，其后又迅速回升，始終徘徊在3.0附近;1-4由2.72直降到1.69，并維持在這個(gè)水平上，只在182 d有一個(gè)小幅波動(dòng)。1-3和1-5變化基本相同，分別在感染后45 d和64 d降到最低，并且出現(xiàn)倒置，其中 1-5甚至降到0.5以下，其后反彈并一直維持在0.8-1.0之間。1-6與1-3、1-5趨勢(shì)相同，變化幅度小，沒有出現(xiàn)倒置，始終維持在1.0以上，最低值1.02出現(xiàn)在85 d(圖2)。

圖2 SHIVSF162p3小劑量多次陰道途徑感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值Fig.2 Changes of CD4+/CD8+ratio of T lymphocytes in the Chinese-original rhesus macaques infected IVAG with repeated low dose of SHIVSF162p3

2.3 SHIVSF162p3感染猴外周血CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)

所有實(shí)驗(yàn)猴的CD4+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)在感染50 d內(nèi)都基本保持穩(wěn)定，在1 000個(gè)/μL全血上下浮動(dòng)，隨后均有逐步下降，但下降幅度不大，最低值始終在600以上(具體數(shù)據(jù)未顯示)。只有1-1下降幅度較大，到感染后274 d時(shí)，已降到293個(gè)細(xì)胞/μL猴血(圖 3)。

圖3 SHIVSF162p3陰道途徑感染恒河猴1-1外周血CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的變化Fig.3 The CD4+T cell counts(per 1 μL blood)in the Chinese-origin rhesus macaque 1-1 infected IVAG with repeated low dose of SHIVSF162p3

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來，在世界范圍內(nèi)性傳播是HIV-1感染的主要原因并且這種傳播趨勢(shì)仍呈上升狀態(tài)。因此，陰道途徑感染的恒河猴模型更能符合艾滋病感染的新趨勢(shì)并成為當(dāng)今關(guān)注的熱點(diǎn)。在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，緊貼子宮陰道上皮的黏膜固有層中存在大量的郎格漢斯細(xì)胞(Langhans cell)，而這種細(xì)胞只表達(dá)CCR5受體而不表達(dá)CXCR4受體。因此，作為單一CCR5受體特異性的SHIVSF162p3病毒的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)顯現(xiàn)出來，成為目前國(guó)際上應(yīng)用比較多的黏膜途徑感染用SHIV病毒。而小劑量多次感染也由于更接近人的自然感染狀態(tài)，成為目前一種比較新穎的攻毒策略。

本研究中我們使用 Cecilia教授提供的SHIVSF162p3，并采用小劑量連續(xù)多次陰道感染的策略，感染6只中國(guó)恒河猴，共攻毒13次，前6次劑量為20TCID50，后 7次為 30TCID50，比 Cecilia教授等使用的50TCID50要低一倍左右［5］。第一只動(dòng)物陽轉(zhuǎn)是在第6次攻毒后，到13次攻毒結(jié)束后，6只實(shí)驗(yàn)猴已全部被感染。所有實(shí)驗(yàn)猴的病毒載量高峰都達(dá)到了106copies/mL～107copies/mL，并且病毒載量的峰值和CD4+/CD8+的低值之間是一一對(duì)應(yīng)的，尤其是出現(xiàn)較早的1-1到1-4，這和 Cecilia等人采用小劑量連續(xù)多次陰道感染印度恒河猴的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是基本相同的，只是載量的峰值略高一個(gè)數(shù)量級(jí)(Cecilia教授感染印度恒河猴的載量高峰在105copies/mL～106copies/mL之間)。并且除1-1以外，其它實(shí)驗(yàn)猴外周血中CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)沒有大的變化，這一點(diǎn)也與Cecilia教授觀察到的結(jié)果相同。但1-1出現(xiàn)的持續(xù)的CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的下降，并且接近200個(gè)/μL這一現(xiàn)象還是很值得我們注意。通常情況下我們認(rèn)為R5嗜性的SHIV并不如CXCR4嗜性的病毒那樣容易引起CD4+T細(xì)胞的耗竭［4］，尤其是在中國(guó)恒河猴中。1-1出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象是何種因素造成的，還需要我們進(jìn)一步的觀察與分析。

與小劑量多次攻毒所產(chǎn)生的多載量峰值的現(xiàn)象不同，Lily等［6］人采用一次大劑量(103.7TCID50SHIVSF162p3)陰道攻毒后，4只恒河猴病毒載量峰值都達(dá)到了106copies/mL～108copies/mL，其中兩只猴病毒載量 set-point值維持在(105～107)copies/mL直至死亡，它們的外周血CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)也出現(xiàn)較明顯的下降。尸檢結(jié)果表明兩只恒河猴均死于SAIDS。這個(gè)結(jié)果從一個(gè)側(cè)面說明了 SHIVSF162p3具有較強(qiáng)的致病性。

本次研究中，我們沒有使用NIH提供的病毒的TCID50來進(jìn)行中國(guó)恒河猴的SHIVSF162p3的攻毒，而是使用中國(guó)恒河猴PBMCs進(jìn)行了重新滴定。這樣一方面了解了病毒對(duì)中國(guó)恒河猴PBMCs細(xì)胞的感染特性，同時(shí)也消除了運(yùn)輸途中，可能的溫度變化導(dǎo)致病毒毒力的降低。在小劑量攻擊的模型中，由于病毒劑量小，所以滴定的微小誤差可能導(dǎo)致模型的成敗。因此TCID50結(jié)果的準(zhǔn)確對(duì)小劑量攻擊模型來說是至關(guān)重要的。

SHIVSF162p3小劑量連續(xù)多次陰道感染模型除了可以較好的模擬HIV-1疾病過程，也很適合進(jìn)行以包膜為基礎(chǔ)的疫苗效用可行性評(píng)估。當(dāng)然，這并不意味著這一病毒無懈可擊。由于R5-SHIVSF162p3所包含的HIV片段為歐美流行株HIV B亞型片段，而目前中國(guó)HIV流行株絕大多數(shù)為C亞型［7］，所以這并不完全適合評(píng)價(jià)針對(duì)我國(guó)HIV流行特點(diǎn)設(shè)計(jì)的艾滋病疫苗。但是，通過對(duì)R5-SHIVSF162p3的構(gòu)建和生物學(xué)研究，為構(gòu)建適合評(píng)價(jià)我國(guó)艾滋病疫苗的SHIV病毒提供了借鑒。

［1］劉秀英，叢喆，侯俊，等.中國(guó)恒河猴 Mamu-A*01基因篩查及其對(duì)抗原肽p11C的特異性CTL反應(yīng)［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，16(2):100－104.

［2］馮育芳，王衛(wèi)，許琰，等.SIVmac251不同途徑感染恒河猴急性期實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(2):80－83.

［3］叢喆，李兆忠，魏強(qiáng)，等.SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量 RTPCR測(cè)定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷貝數(shù)方法的建立［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2006，14(4):271－275.

［4］王衛(wèi)，劉強(qiáng)，許琰，等.SHIV-KB9感染中國(guó)恒河猴有效濃度的確定［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(2):67－71.

［5］Harouse JM， GettieA， Cheng-MayerC， etal. Mucosal transmission and induction of simian AIDS by CCR5-specific simian/human immunodeficiency virus SHIVSF162P3［J］.J Virol，75(4):1990– 1995.

［6］Tsai L，Trunova N，Cheng-Mayer C，et al.Efficient repeated low-dose intravaginal infection with X4 and R5SHIVs in rhesus macaque:Implications for HIV-1 transmission in humans［J］.Virology，2007，362(1):207– 216.

［7］Wu Z，Sun X，Sullivan SG，et al.Public health.HIV testing in China［J］.Science，2006，312(5779):1475-1476.

Efficient Repeated Low-Dose Intravaginal Infection with SHIVSF162p3in Chinese-Origin Rhesus Macaques

CONG Zhe1，LIU Hao1，DUO Jiang-ying1，WANG Wei1，JIANG Hong1，GAO Hong1，YANG Zhi-wei1，Sylvain Fleury2，WEI Qiang1，QIN Chuan1
(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.Mymetics Corporation，CH 1066 Epalinges，Switzerland)

ObjectiveNonhuman primate models are increasingly used in the screening of candidate AIDS vaccines and immunization strategies for advancement to large-scale human trials.The predictive value of such macaque studies is largely dependent upon the fidelity of the model system in mimicking human immunodeficiency virustype 1(HIV-1)infection in terms of viral transmission，replication，and pathogenesis.The aim of this study was to establish a Chineseorigin rhesus monkey model of CCR5-specific chimeric simian/human immunodeficiency virus(SHIVSF162p3)infection，induced by repeated low-dose intravaginal infection，and explore whether this new chimeric model could be more efficient inAIDS vaccine research.MethodsTotally 6 female Chinese-origin rhesus monkeys were enrolled in this study.All animals were intra-vaginally challenged 13 times with 1 mL of a phosphate buffered virus solution containing the heterologous SHIVSF162p3，with 20 TCID50for the first 7 challenges and 30 TCID50for the remaining 6 challenges.Challenges were done every 4-7 days.Whole blood was collected and plasma virus was quantified by real-time SYBR green RT-PCR and T cell subsets were determined by flow cytometry analysis.ResultsSystemtic infection was successfully established in 6 Chinese-origin rhesus macaques after 13 challenges.The peak of viral loads was between 106copies/mL to 108copies/mL，wherease their CD4+/CD8+ratio was decreased.Conclusions The results of this study provide a firm basis for establishing a Chinese rhesus macaques model of SHIV infection by repeated low dose of SHIVSF162p3，a route more close to natural way of AIDS infection.This model would be very useful for HIV-1 subtype B vaccine and pathogenesis studies.

SHIV;Animal model;vaginal transmission;Chinese-origin rhesus monkey

R33

A < class="emphasis_bold"> 【文章編號(hào)】1

1671-7856(2011)02-0044-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.10

國(guó)家十一五科技重大專項(xiàng)課題 (2009ZX10004-402，2008ZX10001-015-10);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(DWS 201009)。

叢喆，碩士，主管技師，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒分子生物學(xué)和模型研究工作。

秦川，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:分子病理學(xué)，疾病模型。E-mail:Qinchuan@pumc.edu.cn。

2010-10-08