蔣 虹，金 光，叢 喆，鮑琳琳，秦 川，魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺對(duì)甲型H1N1流感病毒的抑制作用

蔣 虹，金 光，叢 喆，鮑琳琳，秦 川，魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 細(xì)胞水平測(cè)試奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺對(duì)甲型流感H1N1病毒的抑制或殺傷作用。方法 通過(guò)在MDCK細(xì)胞系和甲型H1N1病毒株間建立藥物劑量-效應(yīng)關(guān)系確定導(dǎo)致細(xì)胞死亡的效力與抑制病毒復(fù)制的效力的比值(治療指數(shù))，測(cè)試藥物的抗病毒效果。結(jié)果 奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)中毒濃度分別為(1134.7±186.8)μg/mL、(742.0±76.9)μg/mL、(94.6±1.9)μg/mL，對(duì)甲型H1N1病毒的治療指數(shù)(TI)分別為71.19、24.9和3.12。結(jié)論 奧司他韋對(duì)甲型H1N1病毒抑制作用最強(qiáng)，利巴韋林其次，鹽酸金剛乙胺對(duì)甲型H1N1病毒抑制效果較弱。

病毒，甲型H1N1;奧司他韋;利巴韋林;鹽酸金剛乙胺

奧司他韋(oseltamivir)別名：達(dá)菲是特異性抑制神經(jīng)氨酸酶的活性，阻止病毒顆粒釋放的一種最有效的抗流感病毒的藥物，2002年下半年在中國(guó)上市，已廣泛應(yīng)用于臨床治療［1］。抗病毒化合物利巴韋林(ribavirin)又名病毒唑，是單磷酸次黃嘌呤核苷(IMP)脫氫酶抑制劑，抑制IMP而阻礙病毒核酸合成的廣譜強(qiáng)效的抗病毒藥物［2］。鹽酸金剛乙胺(rimantadine hydrochloride)為治療和預(yù)防病毒性感冒的一線用藥，對(duì)于流感的預(yù)防與早期治療均有明顯的效果［3］。但 2009年暴發(fā)“人感染豬流感”疫情，此次疫情的病原為變異后的新型甲型H1N1流感病毒，目前已在人類感染者體內(nèi)發(fā)生變異，變異后的病毒對(duì)流感藥物產(chǎn)生了明顯的抗藥性。世衛(wèi)組織在09年7月首次收到關(guān)于大流行性流感病毒對(duì)奧司他韋具有耐藥性的報(bào)告。隨著世界許多地區(qū)流感活動(dòng)增加［4］，以及抗病毒藥物的使用亦相應(yīng)增多，這些事件的數(shù)量也在穩(wěn)步增加。甲型H1N1A/California/7/09 病毒株［5，6］是 2009 年多區(qū)域檢測(cè)到的動(dòng)物源性的能夠人與人傳播的病毒株，我們選擇奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺3種藥物對(duì)甲型H1N1A/California/7/09體外抑制作用進(jìn)行測(cè)試，對(duì)藥物的抗病毒作用有一基本了解。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和病毒

MDCK細(xì)胞(Madin Darby canine kidney)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所提供，細(xì)胞生長(zhǎng)為含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U青鏈霉素的DMEM(Hyclone)培養(yǎng)液。

甲型H1N1-CA7(A/California/7/09)病毒，雞胚尿囊液［7］。用 MDCK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，維持液為DMEM培養(yǎng)液(Hyclone)含2%胎牛血清(Gbico)和終濃度 2 μg/mL TPCK。病毒半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)為6.5。所有病毒操作在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所生物安全三級(jí)(ABSL-3)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 測(cè)試藥物

奧司他韋(達(dá)菲)，批號(hào)090336，上海藥物所提供。利巴韋林，四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。鹽酸金剛乙胺，批號(hào) Ky-Ru-MHA01，浙江普洛康制藥有限公司提供。用維持液配制藥物至5 μg/mL，作為藥物毒性實(shí)驗(yàn)的起始濃度。0.2 μm濾器過(guò)濾除菌。

1.3 病毒滴定

甲型H1N1病毒接種于MDCK細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，34℃ 5%CO2培養(yǎng)3 d后觀察細(xì)胞病變。棄上清液加入100 μL 0.5%中性紅(Sigma)，37℃避光作用1 h，PBS洗滌3次，每孔加入100 μL乙酸乙醇(1%乙酸50%乙醇)酶標(biāo)儀540 nm讀取吸光度值，計(jì)算病毒的半數(shù)感染劑量(TCID50)［8］。

1.4 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

藥物毒性實(shí)驗(yàn)的起始濃度5 μg/mL，2倍系列稀釋藥物，加入到單層 MDCK細(xì)胞96孔培養(yǎng)板，37℃ 5%CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變。第5天培養(yǎng)板中加入CCK-8(同仁化學(xué)研究所公司)，每孔10 μL，將培養(yǎng)板放于37℃ 5%CO2孵箱中3 h。酶標(biāo)儀讀板測(cè)定吸光度值波長(zhǎng)為540 nm。按 Reed Muench計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的毒性濃度，最大無(wú)毒濃度(TD0)，半數(shù)中毒濃度(TD50)。

1.5 藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)

長(zhǎng)成單層的 MDCK細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，加入100 TCID50病毒，37℃ 5%CO2吸附 2 h，吸去病毒，受試藥物用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基配制，從最大安全濃度起始 2倍系列稀釋，加入到板中，34℃、5%CO2培養(yǎng) 3 d，觀察細(xì)胞病變。去上清液，加入0.5% 中性紅，每孔 100 μL，37℃ 5%CO2作用 1 h。棄去中性紅，PBS(PH 7.2)洗滌3次，棄去96孔培養(yǎng)板中液體，加入乙酸乙醇(1%乙酸50%乙醇)，每孔100 μL，室溫放置15 min，540 nm 測(cè)定 A值。計(jì)算藥物抑制病毒半數(shù)有效濃度(IC50)。

1.6 評(píng)價(jià)指標(biāo)

藥物對(duì)病毒的抑制率的曲線、藥物對(duì)細(xì)胞50%毒性濃度與對(duì)病毒50%抑制濃度的比值(TC50/IC50)即治療指數(shù)(therapeutic index，TI)［9，10］。

2 結(jié)果

2.1 藥物毒性

根據(jù)藥物對(duì)MDCK細(xì)胞破壞率計(jì)算出藥物半數(shù)中毒濃度和藥物的安全濃度，奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺的半數(shù)中毒濃度分別為(1134.7±186.8) μg/mL、(742.0 ±76.9)μg/mL、(94.6 ±1.9)μg/mL(表1)對(duì)細(xì)胞的安全濃度分別為156.3 μg/mL 、78.1 μg/mL 、39.1 μg/mL。

2.2 藥物對(duì)甲型H1N1病毒的抑制作用

奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺與100 TCID50甲型H1N1病毒作用，用細(xì)胞觀察法和中性紅測(cè)試細(xì)胞活性的方法獲得藥物對(duì)病毒的抑制率(圖1)和藥物抑制病毒半數(shù)有效濃度(IC50)(表1)。奧司他韋藥物在對(duì) MDCK細(xì)胞的安全濃度(156.3～19.5)μg/mL對(duì)病毒的抑制率達(dá)到80%以上，隨后濃度到4.88 μg/mL仍有20%的抑制作用，治療指數(shù)為71.19。利巴韋林濃度在(78.13～4.88)μg/mL之間對(duì)病毒的抑制作用80%逐漸遞減，治療指數(shù)為24.90。鹽酸金剛乙胺對(duì)病毒的抑制率只有在濃度為78.3 μg/mL時(shí)達(dá)到50%，治療指數(shù)為3.12。

圖1 藥物對(duì)甲型H1N1-CA7病毒的抑制率(A)奧司他韋、(B)利巴韋林、(C)鹽酸金剛乙胺Fig.1 The inhibition rate of influenza A(H1N1)virus.(A)Oseltamivir phosphate，(B)Ribavirin，(C)Rimantadine hydrochloride

表1 藥物對(duì)甲型H1N1病毒的抑制作用Tab.1 The inhibitory effects of compounds on H1N1-CA7 virus infection

3 討論

三種藥物對(duì)甲型 H1N1A/California/7/09病毒株在細(xì)胞水平抑制病毒的作用測(cè)試結(jié)果表明，奧司他韋抑制病毒作用強(qiáng)，治療指數(shù)、安全性高。據(jù)報(bào)道，奧司他韋抑制神經(jīng)氨酸酶的活性，具有特異性針對(duì)流感病毒釋放的功效，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)與抗病毒類藥物如利巴韋林、鹽酸金剛乙胺相比，顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。雖然利巴韋林對(duì)甲型H1N1A病毒也有一定的抑制作用，但效果不如奧司他韋。鹽酸金剛乙胺對(duì)甲型H1N1A病毒抑制效果較弱。三種藥物通過(guò)細(xì)胞水平測(cè)試得到以上結(jié)果，但實(shí)際在人體內(nèi)、動(dòng)物體內(nèi)的抗病毒作用因藥物代謝作用不得而知，還應(yīng)進(jìn)行深入研究。

［1］ Dharan NJ;Gubareva LV;Meyer JJ，et al.Infection with oseltamivir-resistant influenza A(H1N1)virus in the United States［J］.JAMA，2009，301(10)：1034-1041.

［2］ Eriksson B，Helgstrand E，Johansson NG，et al.Inhibition of influenza virus riboncleic acid polymerase by ribavirin triphosphate［J］.Antimicrob Agents Chemoth，1977，p.946-951.

［3］ 高長(zhǎng)有.鹽酸金剛乙胺防止流行性感冒的療效分析［J］.臨床心身疾病雜志，2007，13(5)：442.

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［8］ 黃禎祥.醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京科學(xué)出版社.1990：661-693.

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Antiviral Activity of Oseltamivir Phosphate，Ribavirin and Rimantadine Hydrochloride on Influenza A/H1N1 Virus in Vitro

JIANG Hong，JIN Guang，CONG Zhe，BAO Lin-lin，QIN Chuan，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To evaluate the antiviral activity of oseltamivir phosphate，ribavirin and rimantadine hydrochloride on influenza A(H1N1)in vitro.Methods Drugs diluted in FCS-free DMEM media supplemented with 2 μg/mL TPCK-treated trypsin was applied to confluent MDCK cell monolayers for 1 h prior to addition of virus，at a challenge dose of one hundred times of the TCID50.The IC50of drugs were calculated using neutral red assay after 3 days treatment at 34℃.Results The therapeutic index(TI)of oseltamivir phosphate against influenza A(H1N1)virus was 61.90，ribavirin was 42.86，and rimantadine hydrochloride was 6.22.Ubenimex was lower than 1.00.Conclusions Influenza virus is sensitive to oseltamivir phosphate and ribavirin.The antiviral effect of rimantadine hydrochloride is significantly lower than that of oseltamivir phosphate and ribavirin.

Influenza A(H1N1)virus;Oseltamivir phosphate;Ribavirin;Rimantadine Hydrochloride

R33

A

1671-7856(2011)02-0023-03

2010-09-27

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.06

北京市科技計(jì)劃課題，編號(hào)：Z09000700090904。

蔣虹，女，研究方向：實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)。

魏強(qiáng)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：病毒學(xué)。