鮑琳琳，孫惠惠，占玲俊，許黎黎，鄧 巍，李楓棣，呂 琦，朱 華，秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

甲型H1N1流感病毒感染小鼠的發(fā)病機(jī)制

鮑琳琳，孫惠惠，占玲俊，許黎黎，鄧 巍，李楓棣，呂 琦，朱 華，秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

目的 甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009感染BALB/c小鼠，研究甲型H1N1流感病毒病毒性肺炎發(fā)病機(jī)制。方法 4～6周齡雌性BALB/c小鼠60只，隨機(jī)分為2組，實驗組和對照組，每組30只。CA7流感病毒滴鼻制備甲流病毒感染小鼠模型。攻毒后第5天解剖實驗和對照組小鼠，取肺組織，測定肺組織中IL-2，IL-6，TNF-α含量。結(jié)果 結(jié)果實驗組肺組織中IL-6，TNF-α，水平明顯高于對照組，IL-2水平明顯低于對照組，差異均有顯著性(P＜0.05)。結(jié)論 IL-6、TNF-α、IL-2這3種細(xì)胞因子在感染甲流病毒后的顯著性變化與病毒感染后的肺組織病理損傷有密切的關(guān)系。

A/California/7/2009;BALB/c小鼠;發(fā)病機(jī)制;細(xì)胞因子

研究證明細(xì)胞因子在呼吸道合胞病毒(RSV)等病毒性肺炎發(fā)病中發(fā)揮重要作用。有研究報道通過流感病毒感染人體實驗發(fā)現(xiàn)，呼吸道局部和血清中IL-6、TNF-α水平，與臨床癥狀密切相關(guān)。IL-2本身無直接抗病毒作用，它能刺激T細(xì)胞產(chǎn)生多種淋巴因子，誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子，而起到抗病毒作用。為研究H1N1甲型流感病毒的病原特性、致病機(jī)理建立了小鼠感染甲型H1N1病毒的動物模型。本研究應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對甲型H1N1流感病毒感染模型小鼠肺組織 IL-2、IL-6、TNF-α水平進(jìn)行檢測，以明確其與小鼠的病毒性肺炎的發(fā)生是否存在相關(guān)性及其意義。

1 材料和方法

1.1 病毒

H1N1病毒株為 A/California/7/2009。經(jīng)無特殊病原體(specific pathogen free，SPF)雞胚增殖后收集病毒尿囊液，TCID50為107。-80℃儲存?zhèn)溆?，實驗均在生物安全Ⅲ級實驗室中進(jìn)行。

1.2 動物

實驗動物均選用SPF級雌性BALB/c小鼠，4～6周齡(體重14～16 g)。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供(許可證號：SCXK(京)2004-0001)。

1.3 實驗儀器和試劑

RVC-Ⅱ型獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具 Tecniplast公司;AMV反轉(zhuǎn)錄酶及 RNA酶抑制劑購自 Promega公司;Taq plus DNA聚合酶及dNTP購自TaKaRa公司。ELISA試劑盒R＆B公司。

1.4 感染小鼠

實驗在本所的BSL-3實驗室中進(jìn)行。將60只4～6周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組和實驗組。每組30只，每籠5只。標(biāo)記后分別稱重。將小鼠乙醚吸入麻醉后，106TCID50病毒液通過滴鼻途徑感染小鼠，每只小鼠的接種劑量為50 μL，對照組小鼠經(jīng)鼻腔滴入等量的生理鹽水。獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中正常飼養(yǎng)。實驗的觀察期為14 d。其中每組20只感染第5天處死，處死后取肺組織做進(jìn)一步機(jī)制研究。

1.5 觀察指標(biāo)

每日觀察記錄小鼠的活動狀態(tài)及臨床表現(xiàn)，稱量體重。感染小鼠第5天處死后取肺組織，做病毒載量測定。肺組織用夾心法測定 IL-2、IL-6、TNF-α，IFN-γ細(xì)胞因子。肺組織病理檢查用甲醛固定、石蠟包埋、常規(guī)HE染色，光鏡下觀察其病理變化。稱量每只死亡小鼠的體重及肺臟濕重，計算其肺指數(shù)(肺臟濕重/小鼠體重)。

1.6 檢測方法

1.6.1 細(xì)胞因子檢測：感染小鼠第5天放血處死，每組各取10只，取全肺，在低溫條件下，按常規(guī)方法制作肺組織勻漿后取上清液，檢測采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測肺組織細(xì)胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL–6的蛋白表達(dá)。

1.6.2 肺組織病毒載量測定：根據(jù)中國CDC公布的H1N1亞型禽流感病毒核蛋白基因的保守序列設(shè)計一對引物：SW-H1 F786：5’-AATAACATTAGAA GCAACTGG-3’;SW-H1 R920：5’-AGGCTGGTGTT TATRGCACC-3’。擴(kuò)增片段的大小為134 bp。常規(guī)方法提取 RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μL，加至 25 μL PCR 反應(yīng)體系中，瞬時離心后置ABI Step One PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：35循環(huán)，94℃ 30 s變性，59℃ 30 s退火，72℃ 60 s延伸。95℃，15 s;60℃，1 min，60℃ ～ 95℃ 每 0.3℃ 記錄Tm值，記錄溶解曲線。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

小鼠的體重變化用體重百分比表示，即以小鼠當(dāng)天體重減去其前1 d體重的差值作分子，以其前1 d的體重作分母，記錄為平均體重變化百分比±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)值采用每組的平均數(shù)。小鼠的平均存活天數(shù)(MSD)按照公式：MSD=Σ［f(d-1)］/n計算，其中d為天數(shù)，f為第n天幸存的小鼠數(shù)目，n為每組的小鼠數(shù)目。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)注差表示，實用軟件SOSS15.0對組間差異應(yīng)用t檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 甲流病毒感染對小鼠生存質(zhì)量的影響

甲型流感病毒感染小鼠后第3天，實驗組小鼠體重就開始下降，體重下降最多達(dá)17.0%。感染后第3天開始出現(xiàn)豎毛，攝食量下降，活動度下降，嚴(yán)重。小鼠在感染后第3～4天開始死亡，感染8 d后10只小鼠全部死亡。對照小鼠未見異常。感染后的小鼠肺指數(shù)與對照組比較明顯增加。感染后的小鼠存活情況，體重變化，及肺指數(shù)變化(表1)。

2.2 甲流病感染小鼠肺組織病毒復(fù)制

甲流病毒感染后的小鼠，第5天處死，取肺組織做病毒載量分析。結(jié)果顯示小鼠感染后肺組織的病毒載量在(5.7±0.17)log10 copies/mg(表2)。

2.3 實驗組與對照組小鼠血清IL-2、IL-6和INF-γ水平

各細(xì)胞因子水平在攻毒變化顯示，實驗組較對照組 IL-6、IFN-γ明顯升高(P ＜0.01)，IL-2明顯降低(P＜0.05)(表2)。

2.4 甲流病毒感染小鼠病理組織學(xué)觀察

實驗組小鼠支氣管肺組織病理表現(xiàn)是毒性肺炎特點(diǎn)。剖檢可見感染小鼠肺臟有明顯充血和水腫，肺體積變大，肺組織表面有局部輕度實變，呈斑點(diǎn)狀充血。光鏡下主要改變是肺組織肺泡間隔不同程度增寬，肺內(nèi)小血管及肺泡間隔的毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血，肺泡腔不同程度縮小，可見中等量淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(圖1，見彩插2)。

表1 小鼠感染CA7流感病毒結(jié)果Tab.1 Results of mice infected with CA7 virus

表2 小鼠感染CA7流感病毒細(xì)胞因子變化Tab.2 Virus loads and cytokines in the lung of mice infected with CA7 virus

3 討論

感染甲型H1 N1流感病毒小鼠肺組織組織病理呈間質(zhì)性肺炎變化［1-2］。09年爆發(fā)的甲型H1N1流感傳播速度快感染人群多，感染的人群多，病患多以上呼吸道感染為主要癥狀，嚴(yán)重者發(fā)展成為間質(zhì)性肺炎，病死率在0.1% ～0.2%之間。既往研究證明流感病毒感染可波及肺間質(zhì)和肺泡而引起肺炎，細(xì)胞因子在其發(fā)病中有重要作用［3］。病毒感染后通過細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用，激活內(nèi)皮細(xì)胞和粒細(xì)胞，繼而調(diào)節(jié)黏附分子的合成及其在細(xì)胞表面的表達(dá)。TNF-α是一種由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的基因多顯性的細(xì)胞因子，其生物活性均通過細(xì)胞表面的特異受體傳遞信號。TNF-α水平升高時［4］，可介導(dǎo)炎性反應(yīng)的許多病理生理過程，引起局部炎性反應(yīng)、器官的損害、甚至系統(tǒng)的損害。它可刺激單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分泌 IL-6、IL-1進(jìn)入血液循環(huán)［5］，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化作用和局部浸潤，吞噬和殺傷病原體，從而啟動炎性反應(yīng)。本研究實驗組小鼠血清TNF-α水平明顯升高，說明甲流發(fā)病中，TNF-α是重要的炎性介質(zhì)，發(fā)揮了重要作用。IL-6是一種多組織親和性的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)有關(guān)的多種過程，由單核巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，還可被TNF-α、IL-1誘導(dǎo)及多種細(xì)胞產(chǎn)生，在肺炎支原體感染時，IL-6的產(chǎn)生、釋放異常，IL-6參與整個炎性反應(yīng)部位的炎性損傷。IL-2主要由CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，此外CD8+T細(xì)胞和 NK細(xì)胞也可產(chǎn)生［6］。在小鼠，主要由Th1亞群產(chǎn)生。IL-2本身無直接抗病毒作用，它能刺激T細(xì)胞產(chǎn)生多種淋巴因子，誘導(dǎo) CTL、NK、LAK等多種殺傷細(xì)胞的分化和效應(yīng)功能，誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子，而起到抗病毒作用。病毒感染后，IL-2水平降低，引起機(jī)體免疫功能的抑制和失調(diào)［7-8］。本實驗中，在人工感染后的第 5天，IL-2水平降低，進(jìn)一步引起機(jī)體免疫功能的抑制和失調(diào)。IL-6表達(dá)水平上升，發(fā)揮其刺激局部炎性反應(yīng)，促進(jìn)組織破壞作用。TNF-α水平升高，引起局部炎性反應(yīng)、器官的損害。提示它們之間是相互誘導(dǎo)、相互協(xié)同、共同參與甲流病毒感染的發(fā)生、發(fā)展過程。

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Pathogenesis of Influenza A(H1N1)Virus in Infected Mice

BAO Lin-lin，SUN Hui-hui，ZHAN Ling-jun，XU Li-li，DENG Wei，LI Feng-di，LV Qi，ZHU Hua，QIN Chuan
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To study the mechanism of the influenza virus infection in BALB/c mice with A/California/7/2009Influenza H1N1 virus.Methods Sixty BALB/c mice were randomly divided into 2 groups：experimental group and control group，each group consisted of 30 mice.The CA7 influenza virus was used to establish influenza models.The expressions of lung IL-6，TNF-α，and IL-2 in experimental group of 5thday control group were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Results The lung tissue IL-6，TNF-α levels were significantly higher，IL-2 levels were significantly lower than that in the control group，the differences were significant(P ＜0.05).Conclusions The cytokines IL-2，IL-6 and TNF-α may participate in the whole process of influenza A H1N1 virus infection and their lung levels are positively correlated with the severity of the disease.

A/California/7/2009;BALB/c mice;cytokine;mechanism

R33

A

1671-7856(2011)02-0020-03

2010-10-12

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.05

科技重大專項-艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治：2009ZX10004-402，009ZX10004-016;衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項項目：200802036;中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)：DWS200810。

鮑琳琳，助理研究員，研究方向：病毒學(xué)。

秦川，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：chuanqin@vip.sina.com。