葛惠，馬淑鳳，吳聰，楊濟澤，樂國偉，施用暉

(江南大學食品學院，食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

荸薺芡實蓮子復合功能飲料的抗氧化活性*

葛惠，馬淑鳳，吳聰，楊濟澤，樂國偉，施用暉

(江南大學食品學院，食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

研究以荸薺、芡實、蓮子為原料的復合功能飲料的生物抗氧化活性。利用α-淀粉酶水解荸薺、芡實、蓮子并進行復配，對不同配比的復合飲料進行體外及體內(nèi)抗氧化實驗;將復合飲料對小鼠飲水4周，測定血液自由基水平并進行跳臺、穿梭行為學實驗。結(jié)果顯示:復合飲料對·OH自由基體外清除率為34.92%，DPPH自由基清除率達到80.58%;小鼠復合飲料飲水組血液自由基比對照組顯著降低了38.59%(P＜0.05);與對照組比較，小鼠跳臺潛伏期顯著升高，錯誤次數(shù)降低(P＜0.05);暗室反應潛伏期比對照組也顯著減少(P＜0.05)。說明荸薺復合功能性飲料對小鼠的抗氧化和學習記憶能力有改善作用。

復合功能飲料，自由基，小鼠行為學

復合蔬菜汁能較好地實現(xiàn)不同蔬菜汁營養(yǎng)成分的互補和風味的配合，營養(yǎng)價值高于單一蔬菜汁，并且克服了單一蔬菜汁風味、口感差的缺點［1］。江南一帶盛產(chǎn)水生蔬菜，其中荸薺肉質(zhì)白嫩，醇甜清香，甘美爽口，是生產(chǎn)果蔬汁飲料的優(yōu)質(zhì)原料;芡實以淀粉為主，另含抗壞血酸、生育酚、氨基酸、葡糖基甾醇類等抗氧化物質(zhì);蓮子除含有大量的淀粉、蛋白質(zhì)外，還富含多酚類化合物，酚類化合物作為一種天然的抗氧化劑，能夠清除自由基和螯合金屬離子［2］。從中醫(yī)學角度，荸薺具有利尿作用，芡實則可治療小便不禁，荸薺、芡實復合具有互補作用，蓮子、芡實等還含有較多的生物堿成分，長期食用有較好的“降火”功效。荸薺、芡實、蓮子中都含有大量的淀粉等碳水化合物，通過酶解技術(shù)，將其轉(zhuǎn)化為低聚糖和單糖，提高了原料的利用價值，更好的為人體吸收利用。文獻已有研究荸薺果粒飲料［3］、荸薺茶飲料［4］、荸薺-鮮蓮子復合飲料［5］、蓮子汁飲料［6］、芡實飲料［7］等。本文重點從飲料的體外抗氧化能力、對血液自由基的清除能力、對小鼠行為學實驗方面考察復合飲料的功能性特點。

1 材料與設備

1.1 主要材料

新鮮荸薺，江蘇泰州產(chǎn);干芡實，產(chǎn)自江蘇揚州;干蓮子，產(chǎn)自江蘇寶應;中溫α-淀粉酶，2 000 u/g，無錫市科能技術(shù)有限公司;昆明種雄性成年小鼠，體重20～22 g，上海斯萊克實驗動物有限公司(合格證號:00800161407)

1.2 主要設備

WX-80A型旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司;DL－5低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠;ZH-500型小鼠光電刺激跳臺，淮北正華生物儀器設備有限公司;ZH-DSX2型大鼠避暗－穿梭箱，淮北正華生物儀器設備有限公司;MPI－B型多參數(shù)化學發(fā)光分析檢測系統(tǒng)，西安瑞邁分析儀器有限公司;MP1100B電子天平，上海第二天平儀器廠;LS-B50L立式高壓消毒器，上海醫(yī)用核子儀器廠。

2 試驗方法

2.1 復合飲料的制備

(1)荸薺→清洗→去皮→切片、破碎→榨汁→荸薺汁→水解

(2)芡實、蓮子→烘干→粉碎→過篩→加水→水解

(3)荸薺、芡實、蓮子水解液→復配→澄清→過濾→脫氣→灌裝殺菌→感官評定→成品

2.2 荸薺、芡實、蓮子的體外抗氧化活性測定

2.2.1 ·OH自由基清除率的檢測

參照范冠宇等［8］用分光光度法測定光密度值。

2.2.2 DPPH自由基清除率的測定

參照連喜軍等方法［9］測定吸光度，計算公式為:

式中:Ai，樣品組吸光度值;Aj，空白組吸光度值;Ao，對照組吸光度值。

2.3 荸薺復合飲料體內(nèi)抗氧化活性檢測

2.3.1 小鼠的飼養(yǎng)與分組

昆明種雄性小鼠30只，平均體重(20±2)g，預飼1 w，空腹稱重，根據(jù)體重隨機分為3組，每組10只，飼喂正常飼料分別飲用無菌水記為對照組，實驗1組飲用荸薺芡實復合汁，實驗2組飲用荸薺芡實蓮子復合汁。共喂養(yǎng)4 w。

小鼠置安靜環(huán)境，保持動物生活環(huán)境通風及清潔衛(wèi)生。小鼠籠養(yǎng)，每籠5只，室溫(2±3)℃，濕度55%，自然光照、通風。自由飲水攝食，每周稱量小鼠體重。飼養(yǎng)21 d后進行小鼠行為學實驗，28 d實驗結(jié)束時尾部取血備用。

2.3.2 小鼠血液自由基的測定

采用魯米諾化學發(fā)光法測定機體自由基［10］。

2.3.3 小鼠跳臺實驗

分次將3組小鼠放入跳臺儀底部電柵上，然后通電(AC，21V)。小鼠受到電擊后其正常反應是跳上跳臺，躲避電擊。訓練5 min后，小鼠獲得記憶，表現(xiàn)出在跳臺上的時間延長，受到電擊的次數(shù)減少。實驗時，將動物放入儀器內(nèi)的跳臺上，底部電柵通電(AC，21V)，實驗時間設置5 min，分別記錄第一次錯誤跳下跳臺的時間記為潛伏期和5 min內(nèi)小鼠跳下跳臺受到電擊的次數(shù)，即錯誤次數(shù)。

2.3.4 小鼠暗室反應

穿梭箱為長方形盒(50 cm×23 cm×30 cm)，用一帶門(7 cm×5 cm)隔板分成安全區(qū)和點擊區(qū)，電擊區(qū)底部為可通用的銅柵欄(間隔0.5 cm)，頂部有一聲源。實驗分為訓練和正式測試2部分。挑選對電擊反應較為一致的小鼠進行訓練，將小鼠放入穿梭箱內(nèi)適應環(huán)境1 min，然后置于電擊區(qū)，以聲音為條件刺激，響10 s后，以電擊(20V)為非條件刺激，使小鼠逃向安全區(qū)。訓練期4 d，每天10次，每次間隔2～3 min。從聲音響起開始計時記為小鼠的潛伏期。第5天進行正式測試，觀察10次反應。記下反應所需時間。

3 結(jié)果分析

3.1 荸薺復合飲料的體外清除自由基能力

荸薺的水解液(B)、荸薺+芡實的水解液(BQ)、荸薺+芡實+蓮子水解液(BQL)組按比例混合后分別稀釋至原濃度的5%，25%，50%，75%，100%，不同濃度Vc作為對照?！H自由基、DPPH自由基的清除率如圖1、圖2。

圖1 不同濃度的復合汁·OH自由基清除率

圖1表明，4組·OH自由基清除率都隨著濃度稀釋百分率增大逐漸增強，當稀釋倍數(shù)較低時，B組明顯低于BQ組、BQL組、VC組，說明荸薺組在較低濃度下對·OH自由基的清除能力不強;隨著稀釋百分率的進一步增大，VC組顯示出了傳統(tǒng)抗氧化劑的優(yōu)勢，清除效果較明顯，而BQL組清除能力也明顯大于BQ組和B組。這說明了在添加蓮子的基礎上，復合汁有較強的清除·OH自由基的能力。

酶解技術(shù)把原料中大量的淀粉等碳水化合物分解成為低聚糖和單糖，可以更好的為人體吸收利用。低聚糖的免疫、益生作用可能與體內(nèi)自由基、酶類和非酶類抗氧化劑的代謝調(diào)控密切相關(guān)。H2O2/Fe2+體系中低聚糖對·OH自由基的清除能力較強，從而可以推斷，其抗氧化機理可能是作為金屬離子絡合劑，絡合了體系中的Fe2+，降低了Fenton反應的速率，從而間接實現(xiàn)抗氧化作用。Chen等［11］就研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖能螯合Cu2+，抑制Cu2+催化的過氧化反應，體現(xiàn)出抗氧化活性。而蓮子里除了含有大量的淀粉外，還富含酚類化合物，其作為一種天然的抗氧化劑，能清除自由基和螯合金屬離子［12］，所以在復合飲料中添加蓮子能顯示出較強的抗氧化能力。

圖2 不同濃度的復合汁DPPH自由基清除率

圖2表明，各組清除DPPH自由基能力隨著濃度的增大而增加，BQL組在低于75%的稀釋倍數(shù)下有較強的清除DPPH自由基的能力，明顯高于其他3組。隨著濃度的增加，3組都有不同程度的增加，劑量達到100%時，VC組和BQL組遠遠大于BQ組和B組，其中BQL組的清除率約為81%，比馬曉佩［13］研究的黑米功能飲料57%的清除率高出了29.6%，比沈晨［14］研究的紅景天復合飲料49%的清除率高出了39.9%。

DPPH具有單電子而使其在λ=517 nm處有一強吸收(深紫色)，當有自由基清除劑與單電子配對而使其吸收逐漸減弱(顏色變淡)或消失。一般褪色濃度與其所接受的電子數(shù)呈定量關(guān)系。飲料原料的性質(zhì)決定了飲料中主要含有大量的低聚糖和單糖，低聚糖是多羥基類化合物，多羥基類化合物抗氧化活性的強弱與分子中質(zhì)子氫的提供能力有關(guān)，羥基是活潑的氫供體，氫質(zhì)子直接參與自由基的清除作用，母核上“OH”基團數(shù)越多，提供氫質(zhì)子能力越強，清除自由基能力越強［15］。復合飲料在添加蓮子的情況下清除自由基能力更強，還可能與蓮子中含有大量的多酚類物質(zhì)有關(guān)。多酚物質(zhì)含有大量的酚羥基，酚羥基能夠有效清除自由基，還能夠阻斷或終止自由基的鏈式反應，因此多酚表現(xiàn)出很強的抗氧化性。

3.2 荸薺復合飲料對小鼠的血液自由基水平的影響

對照組飲用無菌蒸餾水;實驗1組:飲用荸薺芡實復合汁;實驗2組:飲用荸薺芡實蓮子復合汁。

表1 荸薺復合飲料對小鼠血液自由基的影響

表1表明，實驗1組和實驗2組均降低血液自由基濃度，實驗1組與對照組有差異但是沒有顯著性差異，實驗2組與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，比對照組顯著降低了38.59%，說明飲用荸薺芡實蓮子復合飲料對機體血液自由基有顯著清除效果。產(chǎn)生各種自由基的器官主要是亞細胞結(jié)構(gòu)和其代謝環(huán)節(jié)，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微粒體、漿膜、胞漿、過氧化體、細胞核、多形核細胞、血紅蛋白等，已知很多種疾病的發(fā)生發(fā)展與異常的自由基反應有關(guān)，特別與自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應有關(guān)，這些失控和異常的自由基反應是由于生理條件下產(chǎn)生的自由基引發(fā)的，因此研究自由基清除劑的作用具有重要生理意義和實用價值。唐兆新等［16］檢測了雞體血液自由基和某些組織器官的自由基含量，表明血液與肝臟、脾臟、心肌的自由基含量呈正相關(guān)，證實了血液自由基含量可以直接反映各組織器官的自由基代謝狀況。王海寬［17］把飲用了4種不同復合保健飲料的小鼠和正常小鼠作對比，結(jié)果顯示，4種中藥復合飲料均能明顯提高小鼠的血液、肝、腦、心臟等組織中的 SOD活性，并能降低MDA含量。于飛等［18］把飲用了S863天然果蔬飲料的小鼠骨骼肌中的SOD含量、MDA含量作對比，結(jié)果顯示適量補充S863天然果蔬飲料對機體的確具有抗氧化作用，且對運動機體自由基失衡也具有一定的調(diào)控作用。以上均說明復合功能性飲料在生物學上確實具有很好的抗氧化特性。

3.3 小鼠行為學實驗結(jié)果

采用小鼠跳臺和暗室反應實驗，測定研究荸薺復合飲料對小鼠記憶及學習能力的影響，結(jié)果見表2，表3。

表2 荸薺復合飲料復合飲料對小鼠跳臺的影響

表2結(jié)果表明，實驗2組和對照組、1組的潛伏期比較有顯著性差異(P＜0.05)，潛伏期比對照組延長了78.8%，比實驗1組延長了30.9%;錯誤次數(shù)中三者沒有顯著性差異，實驗2組比對照組錯誤次數(shù)減少了13.8%，比實驗1組減少10.4%。顯著。

表3 荸薺復合飲料對小鼠暗室反應的影響

如表3所示，實驗2組和對照組、實驗1組有顯著性差異(P＜0.05);實驗1組和對照組有差異但是沒有顯著性差異。實驗2組的潛伏期比實驗1組縮短了10.6%。以上也進一步表明了荸薺、芡實、蓮子復合飲料對小鼠學習記憶有明顯的改善作用。學習和記憶是哺乳類動物生存的重要基礎，學習是神經(jīng)系統(tǒng)接受外界環(huán)境變化獲得新行為、經(jīng)驗的過程，記憶是學習后經(jīng)驗的保持和再現(xiàn)，因此學習和記憶是2個相互有聯(lián)系的神經(jīng)過程，有賴于全腦功能的整合。在行為學水平的跳臺實驗和暗室實驗均測試各組動物非陳述性記憶和陳述性記憶的獲得、鞏固、再現(xiàn)情況。結(jié)合本實驗的結(jié)果證實，荸薺芡實蓮子復合飲料的確有促進學習記憶的作用，且對學習記憶整個神經(jīng)活動中的獲得、鞏固及再現(xiàn)3個基本神經(jīng)活動過程均有明顯的保護作用。

3.4 體外抗氧化活性與小鼠生物學指標的相關(guān)分析

通過表4可以看出小鼠跳臺潛伏期與血液自由基的呈極顯著負相關(guān)(P﹤0.01)，表明血液自由基下降的同時，小鼠對跳臺區(qū)域的辨別能力和自我保護能力升高;暗室潛伏期與血液自由基呈極顯著正相關(guān)(P﹤0.01)，表明小鼠在血液自由基降低的同時對暗室出口的記憶能力增強;說明體內(nèi)血液自由基水平的大小與小鼠行為學實驗是相關(guān)的，即小鼠體內(nèi)的血液自由基清除率越高，小鼠的學習和記憶能力也得到改善。何璐等［19］研究孕酮的長期補充治療可以通過組織抗氧化作用，抵抗脂質(zhì)過氧化反應，提高組織的抗氧化能力，來緩解或改善小鼠學習記憶功能障礙。

林茂等［20］通過不同劑量的白藜蘆醇能有效地清除體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物MDA，增強SOD和GSHPX的活性，對阿爾茨海默病模型小鼠學習能力和記憶功能都有一定的保護，同時提高了機體的抗氧化能力。綜上說明了荸薺復合功能飲料在小鼠的機體抗氧化以及學習記憶能力上都有很好的改善作用。

表4 飲用荸薺復合飲料的小鼠血液自由基與行為學指標相關(guān)系數(shù)

4 結(jié)論

荸薺復合飲料通過體外抗氧化實驗證明了荸薺復合飲料具有良好的抗氧化功能;通過小鼠體內(nèi)血液自由基檢測證明了荸薺復合飲料對機體具有良好的抗氧化功能;通過小鼠跳臺實驗(潛伏期:76.00s;錯誤次數(shù):1.12)，暗室反應實驗(潛伏期:10.82s)說明了荸薺復合飲料具有增強學習記憶的功能。復合飲料添加了蓮子后抗氧化活性得到了明顯提高，說明了蓮子在改善飲料的功能上起了很大的作用。

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Study on the Antioxidant Activity of Functional Beverage Made of Water Chestnuts，Lotus and Gorgon

Ge Hui，Ma Shu-feng，Wu Cong，Yang Ji-Ze，Le Guo-wei，Shi Yong-hui
(The State Key Laboratory of Food Science and Technology Jiangnan University，The School of Food Science and Technology at Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The raw materials of the functional beverage were water chestnuts，gorgon fruit and lotus seeds．α-amylase was used to hydrolyze water chestnuts，gorgon fruit and lotus seeds;the antioxidant properties of finish product was tested in vitro and in vivo．Mice were fed with the functional drinks for four weeks．Then free radicals in blood，and platform jumping and the shuttle behavior were determined．The o OH radical scavenging activity of the beverage was 34．92%;however，DPPH radical scavenging reached to 80．58%．The level of radicals in the blood was 38．59%(P ＜0．05)significantly lower than that of control group mice．The platform jumping lateness incresed compared to the control group and errors were reduced;darkroom lateness reaction was lesser than the control group(P＜0．05)．

mixed functional beverage，free radicals，mouse behavior

碩士研究生(施用暉為通迅作者，E-mail:yhshi@jiangnan.edu.cn)。

*科技部十一五支撐計劃(2006BAD27B06)

2011－06－24，改回日期:2011－09－02