曹云濤，孔維寶，，葸玉琴，李龍囡，夏春谷

1(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州，730070)

2(中科院蘭州化學(xué)物理研究所，羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州，730000)

小球藻屬綠藻門(mén)(Chlorophyta)綠藻綱(Chlorophyceae)綠球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻屬(Chlorolla)，是一類(lèi)普生性單細(xì)胞藻類(lèi)［1］。常見(jiàn)的有蛋白核小球藻(C．pyrenoidosa)、橢圓小球藻(C．ellipsoidea)、普通小球藻(C．vulgaris)等［2］。小球藻含豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、食用纖維、維生素、微量元素和活性代謝產(chǎn)物，具有降血壓、降血脂，抗動(dòng)脈粥樣硬化，增強(qiáng)免疫力，抗腫瘤以及抗病毒感染等保健功能［3］。

小球藻除了可以利用光能和CO2進(jìn)行光合自養(yǎng)以外還可以利用一種或多種有機(jī)物作為能源和碳源在黑暗中生長(zhǎng)［4］，即進(jìn)行異養(yǎng)繁殖，類(lèi)似于細(xì)菌的發(fā)酵。除此之外，它還可以在光照條件下，利用有機(jī)碳源進(jìn)行混合營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而且生長(zhǎng)速度和藻密度較高。由于小球藻的這一特性及其較高的應(yīng)用價(jià)值，異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)方式成為微藻生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［5］。目前，有關(guān)小球藻培養(yǎng)的研究國(guó)內(nèi)外主要集中在自養(yǎng)和異養(yǎng)方面［6］，但是對(duì)自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)三者之間的比較研究，特別是較為系統(tǒng)地研究微藻的混養(yǎng)特性的報(bào)道相對(duì)較少。本研究通過(guò)比較分析不同營(yíng)養(yǎng)模式下小球藻的生長(zhǎng)特性和細(xì)胞組成的變化，以期獲得高密度培養(yǎng)小球藻的理想模式，為充分利用這一微藻資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藻種

普通小球藻(Chlorella vulgaris)，購(gòu)自中科院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。

1.1.2 試劑

NaHCO3、葡萄糖、正己烷和培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)鹽等均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 SEM培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為土壤浸出液培養(yǎng)基(g/L):0.250 NaNO3、0.075 K2HPO4· 3H2O、、0.075 MgSO4·7H2O、0.025 CaCl2·2H2O、0.175 KH2PO4、0.025 NaCl、0.005FeCl3· 6H2O，1.0 mL Fe-EDTA、A5 溶液(組分為:2.860 H3BO3、1.810 MnCl2·H2O、0.222 Zn-SO4·7H2O、0.079 CuSO4· 5H2O、0.390 Na2MoO4·2H2O):1.0 mL/L、土壤浸出液:40.0 mL/L。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL－5000B低溫冷凍離心機(jī);LDZX－40B1型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安;電子天平，日本島津;恒溫光照搖床，江蘇太倉(cāng);超凈工作臺(tái)，江蘇蘇凈;日立UV－1800可見(jiàn)紫外分光光度計(jì);酸度計(jì)，美國(guó)奧利龍;溶氧儀，上海雷磁;GY92－2D超聲波細(xì)胞破碎儀，浙江寧波;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，河南鞏義;電熱烘箱，上海一恒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)分為自養(yǎng)、異養(yǎng)、混養(yǎng)3組，每組又根據(jù)不同碳源濃度設(shè)2個(gè)處理，3個(gè)平行。所有處理均在100 mL SEM培養(yǎng)基中接種10mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液，各處理分別添加不同碳源和光照處理(見(jiàn)表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.3.2 培養(yǎng)方法

調(diào)培養(yǎng)基pH至7.2后分裝，121℃高壓滅菌20 min(NaHCO3經(jīng)紫外滅菌后添加于冷卻培養(yǎng)基中以防分解和產(chǎn)生沉淀)。無(wú)菌條件下吸取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液10 mL接入100 mL培養(yǎng)液中，搖勻后置于光照恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，自養(yǎng)和混養(yǎng)組直接暴露于光下，異養(yǎng)組用雙層黑塑料袋遮光處理。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，光強(qiáng)度為2 500 Lux，光周期為12 L:12 D，培養(yǎng)6 d。

1.3.3 測(cè)定方法

1.3.3.1 藻密度測(cè)定方法

采用濁度比色法測(cè)定藻密度，每12 h從培養(yǎng)瓶中取一定量藻液適當(dāng)稀釋后測(cè)660 nm處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線［Y(g/L)=0.385 1×A660－0.017(R2=0.996 7)］計(jì)算質(zhì)量濃度(g/L)。根據(jù)公式:μ=［(ln Xt－ln X0)/(t－t0)］×2.303(其中 X0、Xt分別為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期始末的吸光值，t、t0為相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間)求比生長(zhǎng)速率;并根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間、密度和體積等參數(shù)計(jì)算產(chǎn)率。

1.3.3.2 pH值的測(cè)定

pH采用酸度計(jì)測(cè)定。每48h于無(wú)菌條件下測(cè)定各處理培養(yǎng)液中的pH值。

1.3.3.3 葡萄糖含量的測(cè)定

殘?zhí)呛康臏y(cè)定采用蒽酮比色法［7］，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程［Y(μg)=321.94 A620+0.804(R2=0.999 4)］計(jì)算葡萄糖含量。

1.3.3.4 光合色素含量的測(cè)定

采用三波長(zhǎng)比色法［8］。

1.3.3.5 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法

采用考馬斯亮藍(lán)染色法［8］。培養(yǎng)結(jié)束后的藻液在4 000 r/min下離心10 min，用無(wú)菌水洗滌藻泥3次，用100 mmol/L NaCl溶液稀釋藻泥，并進(jìn)行細(xì)胞破碎(400 W，20 min，超聲5 s，間歇1 s)，破碎液于4 000 r/min離心10 min后取上清測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程［Y(μg)=92.513 A595－0.7613(R2=0.9996)］計(jì)算可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.3.6 油脂含量的測(cè)定

采用正己烷提取-稱(chēng)重法。4 000 r/min離心10 min收集培養(yǎng)結(jié)束的藻液，蒸餾水洗滌2次，離心收集藻泥并于70℃烘干至恒重;將干藻體用小型研磨器充分研磨至細(xì)粉，用正己烷反復(fù)抽提5次，每次振蕩提取1h，合并提取液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑后在70℃烘干至恒重，稱(chēng)重計(jì)算油脂含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)平行，所列數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析，均為3次平行測(cè)定的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±Std)表示。表中同一行數(shù)據(jù)中不同字母代表在a=0.05水平上存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻生長(zhǎng)特性的影響

采用自養(yǎng)、異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)3種方式對(duì)小球藻進(jìn)行培養(yǎng)，在相同條件下對(duì)其生長(zhǎng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同培養(yǎng)方式對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

從圖1可以看出，3種營(yíng)養(yǎng)方式中，異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)的生長(zhǎng)速率明顯優(yōu)于自養(yǎng)。而在異養(yǎng)和混養(yǎng)兩者中，后者又表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，尤其是在生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，異養(yǎng)方式因?yàn)槟茉次镔|(zhì)消耗殆盡，進(jìn)入衰退期，而混養(yǎng)卻生長(zhǎng)強(qiáng)勁，增長(zhǎng)速度平穩(wěn)。這是由于混合營(yíng)養(yǎng)兼有自養(yǎng)和異養(yǎng)的特點(diǎn)，即在基質(zhì)中葡萄糖消耗完以后小球藻可進(jìn)行自養(yǎng)代謝，使得藻細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)［9］。

碳源是影響小球藻生長(zhǎng)的重要因素。從圖1中可以看出，對(duì)于每一種營(yíng)養(yǎng)方式，較高濃度的碳源可以在一定程度上提高小球藻的生長(zhǎng)速度和生物量的積累，而異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)在生長(zhǎng)后期的差別也從另一個(gè)方面說(shuō)明葡萄糖作為碳源對(duì)小球藻生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，葡萄糖的存在可能彌補(bǔ)了氣體碳源CO2供應(yīng)的不充足，并可能使細(xì)胞在碳源利用中節(jié)省所消耗的ATP和NADPH［10－11］。光照作為另一個(gè)影響小球藻生長(zhǎng)的因素，其重要性在本實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)。另外在一個(gè)光暗培養(yǎng)周期中，光照條件下小球藻的生長(zhǎng)也略快于黑暗條件下。這說(shuō)明光能夠促進(jìn)碳源的代謝和能量的輸送［12］，利于混合營(yíng)養(yǎng)的進(jìn)行。

由表2可以看出異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)的比生長(zhǎng)速率明顯高于自養(yǎng)，分別是其4.25～5.45倍和4.25～4.28倍，這也進(jìn)一步說(shuō)明了圖1的結(jié)論。而從平均產(chǎn)率來(lái)看，混合營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì)更加明顯，其產(chǎn)率為3種營(yíng)養(yǎng)方式中最高，分別是自養(yǎng)、異養(yǎng)的5.79～6.27倍和1.11～1.31倍。因此，混合營(yíng)養(yǎng)是獲得小球藻高密度、高產(chǎn)量、短周期培養(yǎng)的最佳營(yíng)養(yǎng)方式。

表2 不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻比生長(zhǎng)速率及產(chǎn)率的影響

2.2 不同的營(yíng)養(yǎng)方式下培養(yǎng)基的pH和葡萄糖含量變化

pH是影響藻類(lèi)生長(zhǎng)代謝的重要因子之一，培養(yǎng)基的pH值會(huì)影響光合作用中CO2的可用性，在呼吸作用中會(huì)影響微藻對(duì)有機(jī)碳源的利用效率，同時(shí)由于pH值直接影響細(xì)胞膜的滲透性，會(huì)影響微藻細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液中離子的吸收和利用，以及代謝產(chǎn)物的再利用性和毒性［13－14］。圖2為不同營(yíng)養(yǎng)方式下培養(yǎng)基中pH的變化情況。

圖2 不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻培養(yǎng)基pH值的影響

可以看出自養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中pH總體處于增長(zhǎng)的趨勢(shì)且一直保持在堿性范圍。這是由于自養(yǎng)條件下小球藻光合作用強(qiáng)烈，隨著細(xì)胞的增殖而不斷消耗培養(yǎng)基中由 NaHCO3產(chǎn)生的 CO2，導(dǎo)致HCO3－解離。異養(yǎng)條件下pH表現(xiàn)為先降后升，但變化范圍不大，這是因?yàn)樾∏蛟逶诋愷B(yǎng)條件沒(méi)有光能無(wú)法利用環(huán)境中的CO2，導(dǎo)致CO2積累，培養(yǎng)基酸性增加。而混合營(yíng)養(yǎng)pH值介于自養(yǎng)和異養(yǎng)之間，并且有明顯的升降變化，這表明混合營(yíng)養(yǎng)條件下，細(xì)胞的光合作用和呼吸代謝強(qiáng)度存在相互競(jìng)爭(zhēng)和補(bǔ)助，即呼吸代謝產(chǎn)生的CO2會(huì)被光合途徑中的CO2泵回收重新利用。混合營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基中pH的變化可能與葡萄糖代謝副產(chǎn)物的某些小分子有機(jī)酸有關(guān)［15］。另外，碳源濃度對(duì)pH的影響也可從圖2中體現(xiàn)出來(lái)，異養(yǎng)和混養(yǎng)條件下較高濃度的碳源抑制了培養(yǎng)基中pH的上升，自養(yǎng)條件下則表現(xiàn)為促進(jìn)作用。

圖3為混合營(yíng)養(yǎng)和異養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中葡萄糖含量隨培養(yǎng)時(shí)間的消耗情況?？梢钥闯龌旌蠣I(yíng)養(yǎng)和異養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗趨勢(shì)大體相當(dāng)。但是圖3中也反映出混合營(yíng)養(yǎng)和異養(yǎng)之間仍有輕微差異，這可能是因?yàn)榛旌蠣I(yíng)養(yǎng)有光合作用和呼吸作用產(chǎn)生的CO2回補(bǔ)效應(yīng)，致使對(duì)葡萄糖的消耗不如異養(yǎng)強(qiáng)烈。

圖3 培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基中葡萄糖含量的變化

2.3 不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻光合色素含量的影響

圖4為不同營(yíng)養(yǎng)方式下小球藻葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量的變化。由圖4可知，不同營(yíng)養(yǎng)方式下自養(yǎng)方式積累的葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素明顯高于異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)方式;而異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)相比較，后者光合色素的含量較高。但是自養(yǎng)方式下小球藻的生物量很低，所以其光合色素總量很低。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)條件下的藻液呈淡黃色，這與小球藻在異養(yǎng)轉(zhuǎn)化過(guò)程中出現(xiàn)葉綠素逐漸消失、細(xì)胞呈黃化的現(xiàn)象有關(guān)［16］，也有報(bào)道稱(chēng)小球藻的營(yíng)養(yǎng)方式在從自養(yǎng)向異養(yǎng)轉(zhuǎn)換過(guò)程中，細(xì)胞中葉黃素的含量會(huì)增加［17］。

圖4(a)和圖4(b)為不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻細(xì)胞中葉綠素a和葉綠素b的影響。可以看出異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)條件下單位質(zhì)量小球藻細(xì)胞中葉綠素a和葉綠素b的含量均有所下降，其中異養(yǎng)下降的更為明顯。而在這兩種營(yíng)養(yǎng)方式下，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度越高葉綠素a、b含量反而越低，這表明葡萄糖不利于光合色素的合成，有機(jī)碳作為混養(yǎng)和異養(yǎng)的碳源可能對(duì)微藻的光合活性造成一系列影響［18］。因?yàn)楣庹盏脑?，自養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)條件下葉綠素a和葉綠素b的含量隨小球藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞數(shù)目的增多而提高，其總量的積累也隨之增多，而葉綠素a含量增加的更快;而在異養(yǎng)條件下，小球藻中葉綠素a、b的含量表現(xiàn)為下降，這是因?yàn)榧?xì)胞不能在黑暗中合成葉綠素，隨著細(xì)胞分裂的進(jìn)行，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的葉綠素含量越來(lái)越少［19］。圖4(c)為不同營(yíng)養(yǎng)方式下小球藻中總?cè)~綠素含量的變化。由圖看以看出，總?cè)~綠素含量的變化趨勢(shì)和圖4(a)圖4(b)的相同。

圖4 不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻光光合色素含量的影響

由圖4(d)可知，不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)單位質(zhì)量小球藻中類(lèi)胡蘿卜素含量的影響也很明顯，不同培養(yǎng)方式中以自養(yǎng)條件下類(lèi)胡蘿卜素的含量最高，混合營(yíng)養(yǎng)次之。而在相同的培養(yǎng)方式條件下，碳源的濃度同樣對(duì)小球藻中類(lèi)胡蘿卜素的含量也有影響，表現(xiàn)為高濃度葡萄糖輕微抑制類(lèi)胡蘿卜素的合成。

對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)方式下小球藻總?cè)~綠素含量和產(chǎn)率分析見(jiàn)表3?？梢钥闯?，單位質(zhì)量小球藻中總?cè)~綠素的含量和產(chǎn)率都以自養(yǎng)為最高，但是由于自養(yǎng)方式下的細(xì)胞密度較低，故其總產(chǎn)量也較低，所以自養(yǎng)條件下單位體積藻液中所含總?cè)~綠素較混合營(yíng)養(yǎng)的低，而單位體積藻液中總?cè)~綠素的產(chǎn)率以混合營(yíng)養(yǎng)的最好。所以混合營(yíng)養(yǎng)條件下隨著細(xì)胞密度增大，葉綠素濃度也增加，葉綠素濃度與細(xì)胞密度變化大致存在相同的變化趨勢(shì)。

2.4 不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻蛋白質(zhì)含量的影響

表4中比較了不同營(yíng)養(yǎng)方式下單位質(zhì)量、單位體積蛋白質(zhì)含量以及產(chǎn)率的差異。從表4可以看出，單位質(zhì)量蛋白質(zhì)含量以自養(yǎng)方式下為最高，達(dá)到43.28%，這與李師翁等的［20］研究結(jié)果相一致。但是因自養(yǎng)生物量低的緣故，所以單位體積含量則表現(xiàn)為最低;而混合營(yíng)養(yǎng)方式因?yàn)槠渖锪看螅?xì)胞密度高，其單位體積蛋白質(zhì)含量在不同營(yíng)養(yǎng)方式中為最高，相應(yīng)的其產(chǎn)率也為最高。細(xì)胞在生長(zhǎng)的前期，主要是利用培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行分裂繁殖，增加生物量。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)鹽消耗將盡，生物量積累到一定程度后，細(xì)胞進(jìn)人生長(zhǎng)的平衡期，此時(shí)，開(kāi)始大量分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物，胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與積累主要在此期間進(jìn)行［21］。而混合營(yíng)養(yǎng)方式因?yàn)樽陨淼膬?yōu)點(diǎn)，能夠在小球藻生物量增加以后仍提供營(yíng)養(yǎng)支持，延長(zhǎng)平衡期，以利于胞內(nèi)蛋白的積累，所以混合營(yíng)養(yǎng)同樣也是高密度培養(yǎng)小球藻的前提下獲得高蛋白含量的最佳營(yíng)養(yǎng)方式。

表3 不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻葉綠素含量和產(chǎn)率的影響

表4 不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻蛋白質(zhì)含量和產(chǎn)率的影響

2.5 不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻油脂含量的影響

表5為不同營(yíng)養(yǎng)方式下小球藻油脂含量的比較，從表5中可以看出，對(duì)于3種營(yíng)養(yǎng)方式在單位質(zhì)量、單位體積和產(chǎn)率3個(gè)方面，混合營(yíng)養(yǎng)條件下小球藻油脂積累量為最高，并且明顯優(yōu)于自養(yǎng)和異養(yǎng)方式。尤其是混合營(yíng)養(yǎng)條件下，高濃度的碳源有利于油脂的積累，其油脂含量達(dá)到13%，產(chǎn)率也達(dá)到了44.65mg/(L·d)，這與有關(guān)報(bào)道相符合［22］。從其他2種營(yíng)養(yǎng)方式中也可以看出，高濃度的碳源對(duì)小球藻細(xì)胞中油脂的積累有促進(jìn)作用，這是因?yàn)樘荚礉舛鹊奶岣叽碳ち诵∏蛟宓纳L(zhǎng)，使得小球藻油脂積累進(jìn)程加快，產(chǎn)率也得以提高。所以混合營(yíng)養(yǎng)方式也是小球藻獲得高油脂含量的最佳培養(yǎng)方式。據(jù)桂林等［23］報(bào)道，采用自養(yǎng)、異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)蛋白核小球藻時(shí)發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)條件下粗脂肪含量最高，這和本實(shí)驗(yàn)有出入。這可能是由于藻種的不同或培養(yǎng)基不同的原因所致，因?yàn)樾∏蛟逵椭康母叩屯瑫r(shí)還受基質(zhì)pH、鹽度、C/N、營(yíng)養(yǎng)鹽等因素的影響［24－26］。

表5 不同營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻油脂含量和產(chǎn)率的影響

3 討論

本文比較研究了自養(yǎng)、異養(yǎng)、混合營(yíng)養(yǎng)不同培養(yǎng)條件下，普通小球藻的生長(zhǎng)特性和細(xì)胞組成，考察了不同營(yíng)養(yǎng)方式下小球藻的比生長(zhǎng)速率及產(chǎn)率、培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基中pH和葡萄糖含量、光合色素含量、蛋白質(zhì)含量、油脂含量等方面的差異。結(jié)果表明，混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)是高密度，高生物活性物質(zhì)培養(yǎng)小球藻的最佳方式。在混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)條件下小球藻的比生長(zhǎng)速率和產(chǎn)率為最大，單位體積所合成的光合色素含量高，并且其蛋白質(zhì)和油脂產(chǎn)率也較自養(yǎng)和異養(yǎng)方式下的高。自養(yǎng)條件下單位質(zhì)量的藻體可獲得較高的光合色素和蛋白質(zhì)含量，但其最大的缺點(diǎn)是生物量太低。雖然異養(yǎng)培養(yǎng)使小球藻生物量有了很大提高，但是異養(yǎng)型微藻的種類(lèi)相對(duì)較少［4］。

目前小球藻大規(guī)模培養(yǎng)多使用開(kāi)放式或封閉式池塘培養(yǎng)系統(tǒng)(即自養(yǎng)方式)，這種培養(yǎng)系統(tǒng)成本較低，但自養(yǎng)方式下生物量太低，油脂含量也不高，且易污染。異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻為擴(kuò)大其生產(chǎn)規(guī)模開(kāi)辟了廣闊的前景，但是目前報(bào)道的異養(yǎng)微藻的種類(lèi)相對(duì)較少。研究表明，混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)條件下小球藻的生物量、光合色素、蛋白質(zhì)和油脂產(chǎn)率相對(duì)較高，所以混養(yǎng)方式為生產(chǎn)高密度、高品質(zhì)微藻提供了一種理想模式，而且混合營(yíng)養(yǎng)方式更加符合微藻生長(zhǎng)的實(shí)際環(huán)境，可培養(yǎng)的微藻種類(lèi)相對(duì)較多［27］，具有規(guī)模化生產(chǎn)的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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