沈明花，彭 瀛，宋曉琳

(延邊大學(xué)，吉林 延吉，133000)

我國(guó)食用菌種類很豐富，藥食用菌接近2000余種，但在醫(yī)藥保健品方面的開(kāi)發(fā)利用程度很低。食用菌不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分且其藥理活性也非常廣泛，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、保肝、溶栓［1-5］等功能。目前在國(guó)內(nèi)，有關(guān)食用菌活性成分及相關(guān)功能的深入研究比較少。

榆干離褶傘(Lyophyllum ulmarium，L．u)，又名大榆蘑。屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、離褶傘屬。分布于我國(guó)河北、吉林、黑龍江、河南、甘肅、青海等省。實(shí)驗(yàn)證明，榆干離褶傘菌絲體含有分子量為50 ku的溶栓酶［6］。其發(fā)酵液具有抗氧化作用和保肝作用［7－8］。本課題以榆干離褶傘發(fā)酵液為研究對(duì)象，探討其對(duì)機(jī)體的出凝血時(shí)間、血脂以及體外溶栓作用，為榆干離褶傘的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與試劑

樣品的制備:榆干離褶傘菌種由韓國(guó)益山大學(xué)特種作物加工實(shí)驗(yàn)室提供。在25℃，150r/min液體深層二級(jí)培養(yǎng)15d。將發(fā)酵液用紗布過(guò)濾，收集濾液以3 000r/min離心15 min后將上清液進(jìn)行冷凍干燥，得樣品。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明種小鼠，18～22 g，雌雄各半。家兔，雄性。均由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物科提供。

試劑:阿司匹林腸溶片:吉林華康藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品;洛伐他汀膠囊:揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品;總甘油三酯、總膽固醇試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司。

2 方法

2.1 L．u發(fā)酵液對(duì)血栓的體外溶解作用

采集兔子血置于試管中使其自然凝固。用濾紙吸干血栓表面，各切成0.5g小塊。將血塊放入試管中后分別加入50、100、200 mg/mL濃度的 L．u發(fā)酵液1mL，置于37℃恒溫水浴。隔2、4和8h將血塊取出，吸干稱重，連續(xù)測(cè)定3次，計(jì)算其溶解率。以生理鹽水作為空白對(duì)照組，阿司匹林作為陽(yáng)性對(duì)照組。

2.2 L．u發(fā)酵液對(duì)體外凝血時(shí)間的影響

將兔子斷頭取血。取5支滅活小試管，分別加生理鹽水、一定濃度的阿司匹林和3種不同濃度的L．u發(fā)酵液0.3 mL，然后在每管再加0.5 mL的血液。輕輕振蕩混勻，置37℃恒溫水浴，用玻片法測(cè)定凝血時(shí)間。每管設(shè)3個(gè)平行管。

2.3 L．u發(fā)酵液對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響

將50只小鼠隨機(jī)分為5組，設(shè)正常組、阿司匹林組(5 mg/kg)、用藥小、中、大劑量組(50、100、200 mg/kg)。每日灌胃給藥1次，連續(xù)10d(正常組灌等量的生理鹽水)。末次給藥1h后，以彎頭眼科鑷迅速摘取眼球，將血滴于載玻片兩端各1滴，每隔30s用大頭針輕輕地挑動(dòng)血滴1次，當(dāng)有血絲被挑起時(shí)停止計(jì)時(shí)，記錄凝血時(shí)間，此段時(shí)間為全血凝固時(shí)間，另l滴血供復(fù)驗(yàn)。

2.4 L．u發(fā)酵液對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響

動(dòng)物分組及處理同2.2。采用斷尾法［9］測(cè)定小鼠出血時(shí)間。

2.5 L．u發(fā)酵液對(duì)高脂血癥小鼠血脂的影響

將60只小鼠隨機(jī)分為6組，設(shè)正常組、高脂模型組、陽(yáng)性藥洛伐他汀組、用藥小、中、大劑量組(50、100、200 mg/kg)。每日灌胃給藥1次，連續(xù)10 d(正常組和模型組灌等量的生理鹽水)。于末次給藥后2h，除正常組外，其余各組小鼠均腹腔注射75%新鮮蛋黃乳液(0.5mL/只)造成實(shí)驗(yàn)性高血脂癥。造模后禁食20 h，摘除眼球取血，分離血清，測(cè)小鼠血清中TG、TC的含量。

2.6 測(cè)定方法

均按試劑盒說(shuō)明書操作。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理。

3 結(jié)果

3.1 L．u發(fā)酵液對(duì)血栓的體外溶解作用

由圖1可知，在同一時(shí)間段內(nèi)阿司匹林和L．u發(fā)酵液的溶栓率高于生理鹽水，說(shuō)明它們具有一定的溶栓能力。在6h之前，L．u發(fā)酵液的溶栓能力大于阿司匹林;到8h時(shí)，高濃度L．u發(fā)酵液的溶栓能力與阿司匹林相似，中、低濃度L．u發(fā)酵液的效果低于阿司匹林。

3.2 L．u發(fā)酵液對(duì)體外凝血時(shí)間的影響

圖2所示，不同濃度L．u發(fā)酵液作用以后的凝血時(shí)間長(zhǎng)于阿司匹林組，尤其是中、高濃度組效果顯著，與阿司匹林組有顯著差異。

圖1 L．u發(fā)酵液對(duì)血栓的體外溶解作用

圖2 L．u發(fā)酵液對(duì)體外凝血時(shí)間的影響

3.3 L．u發(fā)酵液對(duì)小鼠出、凝血時(shí)間的影響

如表1所示，除小劑量L．u發(fā)酵液的凝血時(shí)間與正常組無(wú)顯著差異以外，陽(yáng)性對(duì)照組和各用藥組與正常組相比，出血和凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng)。對(duì)用藥組而言，其凝血和出血時(shí)間隨用藥劑量的增加而延長(zhǎng)。

表1 L．u發(fā)酵液對(duì)機(jī)體出、凝血時(shí)間的影響

3.4 L．u發(fā)酵液對(duì)小鼠血脂的影響

如表2所示，模型組總甘油三酯和總膽固醇含量顯著高于正常組，說(shuō)明高脂血癥模型成功。陽(yáng)性對(duì)照組和用藥組顯著降低血脂水平，與模型組相比有顯著性差異。用藥組用藥劑量與血脂水平呈劑量依賴性。

表2 L．u發(fā)酵液對(duì)血脂的影響

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)液態(tài)發(fā)酵技術(shù)，獲得榆干離褶傘發(fā)酵液，對(duì)其進(jìn)行了抗凝、溶栓和降脂方面的試驗(yàn)研究。因發(fā)酵液沒(méi)有經(jīng)過(guò)分離提取等純化過(guò)程，有效成分的濃度相對(duì)低，所以做體外實(shí)驗(yàn)時(shí)用藥濃度比較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L．u發(fā)酵液在體外具有溶栓作用并延長(zhǎng)出、凝血時(shí)間，這就說(shuō)明發(fā)酵液具有抗凝作用。這種抗凝作用有可能作為L(zhǎng)．u發(fā)酵液的溶栓機(jī)制之一。對(duì)榆干離褶傘菌絲體中分離的溶栓酶進(jìn)行特性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該酶在體外可直接水解纖維蛋白和纖維蛋白原［10］。這2種結(jié)果顯示，在液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，榆干離褶傘菌絲體有可能向培養(yǎng)液分泌一些溶栓酶。這種溶栓酶直接或間接地水解纖維蛋白或纖維蛋白原，從而抑制血液凝固和血小板的聚集，起到抗血栓或溶血栓的作用。

高脂血癥是血粘度增高的主要原因，也是加速血栓形成的重要因素之一。血脂增加不僅可使血小板功能亢進(jìn)，而且還抑制纖維蛋白溶解酶原活化素的生成，從而促進(jìn)血栓的形成。另一方面，血脂增加或脂質(zhì)異常都可引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮脫落，組織因子釋放，激活凝血系統(tǒng)，出現(xiàn)高凝狀態(tài)［11］。實(shí)驗(yàn)中還探討了L．u發(fā)酵液對(duì)血脂的影響。研究結(jié)果顯示，發(fā)酵液降低血清總膽固醇和總甘油三酯水平，這就說(shuō)明它可降低血液粘稠度，對(duì)血栓的形成有一定的預(yù)防作用。至于L．u發(fā)酵液是否具有體內(nèi)溶栓作用，其具體活性成分及相關(guān)機(jī)制的研究有待進(jìn)一步研究。

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