馮寧，白亞磊，徐慶陽，謝希賢，陳寧

(天津科技大學生物工程學院，天津，300457)

氮源及其補加策略對L-纈氨酸發(fā)酵的影響*

馮寧，白亞磊，徐慶陽，謝希賢，陳寧

(天津科技大學生物工程學院，天津，300457)

通過分析黃色短桿菌XV0505發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的過程，得知在菌體生長期和快速產(chǎn)酸期氮源對L-纈氨酸發(fā)酵的影響不同。以黃色短桿菌XV0505為供試菌株，研究了不同氮源種類及不同氮源濃度對L-纈氨酸發(fā)酵過程的影響，選定了以豆餅水解液和硫酸銨為氮源，并確定了合適的初始氮源濃度。在初始氮源濃度相同的情況下，考察了間歇流加補氮策略、恒氮源濃度補氮策略和冪函數(shù)流加補氮策略對L-纈氨酸發(fā)酵的影響，研究發(fā)現(xiàn)，冪指數(shù)補氮策略可減少頻繁的取樣及銨濃度檢測，在缺乏在線監(jiān)測系統(tǒng)和反饋自控系統(tǒng)的情況下，將發(fā)酵體系中氮源濃度維持在合適值，既可適度促進菌體生長，又可使L-纈氨酸的產(chǎn)量得到進一步提高。在最優(yōu)的氮源添加策略下，在30 L發(fā)酵罐發(fā)酵60 h，發(fā)酵液中L-纈氨酸可達63.17 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率24.69%。

L-纈氨酸，氮源，補加策略，冪函數(shù)，黃色短桿菌

L-纈氨酸屬于分支鏈氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)，是人體八種必需氨基酸之一，具有多種生理功能，廣泛應(yīng)用于動物飼料、食品及調(diào)味劑和化妝品的制造，尤其是在醫(yī)學研究和治療中的作用，日益受到重視。國內(nèi)外大多采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸，具有原料成本低、反應(yīng)條件溫和及可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點［1］，發(fā)酵水平的高低是決定L-纈氨酸生產(chǎn)成本的主要因素。提高發(fā)酵水平的途徑有2條:一是選育適合工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌種，二是獲得與生產(chǎn)菌種相匹配的最佳發(fā)酵工藝條件和控制手段［2］。然而，我國對于L-纈氨酸發(fā)酵的研究，長期以來側(cè)重于高產(chǎn)菌的選育，對于發(fā)酵過程進行優(yōu)化和控制的研究不多。

氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)和合成L-纈氨酸氨基的重要組成成分，在L-纈氨酸發(fā)酵中的作用至關(guān)重要。但目前為止，對利用黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的研究只集中于不同培養(yǎng)條件對其產(chǎn)量的影響，并沒有系統(tǒng)研究氮源添加濃度和添加策略對發(fā)酵過程和菌體的單一及綜合影響。本文采用黃色短桿菌XV0505發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸，研究表明，在菌體生長期和產(chǎn)酸期XV0505對氮源的需求有差異，因此，研究氮源添加濃度及其不同階段氮源添加策略對黃色短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸過程的影響，將為優(yōu)化L-纈氨酸的生產(chǎn)提供有利的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)XV0505(Leu－+Ile－+2－TAr+α －ABr+ +SGr)，天津科技大學代謝工程研究室保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基(g/L)

1.2.1 活化斜面培養(yǎng)基

葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏 5，NaCl 2.5，瓊脂條25，pH7.0 ～7.2，0.1 MPa，20 min。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖25，豆餅水解液10 mL，玉米漿20 mL，尿素1.2，酵母粉 4，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4· H2O 0.01，VB1300 μg，生物素 200 μg，pH7.0 ～7.2，0.1 MPa，20 min。

1.2.3 基礎(chǔ)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖 140，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，Ile 0.06，Leu 0.2，Met 0.5，VB1200 μg，生物素 100 μg，CaCO320(分消)，pH7.0 ～7.2，0.1 MPa，20 min。

1.2.4 基礎(chǔ)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖 80，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.4，Mn-SO4·H2O 0.01，Ile 0.06，Leu 0.2，Met 0.5，VB1200 μg，生物素 100 μg，pH7.0 ～7.2，0.1 MPa，20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

［3］。

1.4 分析方法

1.4.1 L-纈氨酸含量

應(yīng)用高效液相分析系統(tǒng)測定。色譜分離條件:Agilent C18為色譜分離柱，2，4-二硝基氟苯柱前衍生測定，乙腈與NaAC溶液進行梯度洗脫，柱溫33℃，流動相流量1 mL/min，檢測波長360 nm。

1.4.2 菌體生物量

以菌體干重(DCW)表示，取10 mL發(fā)酵液，離心后用蒸餾水洗滌2次后置于真空干燥箱中干燥至恒重，用分析天平稱重。

1.4.3 葡萄糖濃度

應(yīng)用生物傳感儀 (SBA-40C，山東科學院生物研究所)測定。

1.4.4 NH4+濃度

應(yīng)用多參數(shù)生化分析儀(Bioprofile300，美國Nova公司)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分批發(fā)酵過程中不同氮源種類及濃度對XV0505菌體生長和L-纈氨酸產(chǎn)量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基一般采用含有快速和慢速利用的混合氮源，可以作為L-纈氨酸生產(chǎn)菌的無機氮源有氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、尿素及其他的含氮化合物，有機氮源有蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米漿、酪蛋白水解物、魚粉等［1］。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，以相同物質(zhì)的量的氮為基準，研究了不同氮源對L-纈氨酸搖瓶發(fā)酵的影響，結(jié)果如表1。

表1 不同氮源對L-纈氨酸發(fā)酵的影響

由表1可知，從生物量的角度看，XV0505對豆餅水解液和玉米漿的利用效果都較好，硫酸銨作為氮源的效果也不錯;從產(chǎn)酸的角度看，以豆餅水解液作為氮源，可獲得較高的L-纈氨酸產(chǎn)量，無機氮源中則以硫酸銨為氮源時L-纈氨酸最高;從發(fā)酵時間上看，豆餅水解液能夠縮短發(fā)酵周期，節(jié)約成本。豆餅水解液中含有豐富的生長因子和各種氨基酸，可為菌體的生長提供充分的營養(yǎng)物質(zhì)，使菌體生長旺盛，利于L-纈氨酸的大量積累。而采用硫酸銨作為氮源不僅為菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酸提供氮元素，而且硫元素還可以供給L-纈氨酸合成途徑中必需輔酶(如焦磷酸硫胺素、輔酶A和硫辛酸等)合成的需要，在代謝中起重要作用［2］。經(jīng)綜合考慮，確定以豆餅水解液和硫酸銨作為氮源。

2.2 分批補料發(fā)酵中氮源濃度對XV0505發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的影響

2.2.1 不同豆餅水解液濃度對L-纈氨酸分批補料發(fā)酵的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加2%、3%、4%和5%豆餅水解液，采用5 L發(fā)酵罐進行分批補料發(fā)酵，考察不同濃度有機氮源對L-纈氨酸發(fā)酵的影響。結(jié)果見表2。

表2 不同豆餅水解液濃度下L-纈氨酸發(fā)酵結(jié)果的比較

由表2可知，4%豆餅水解液濃度對L-纈氨酸的發(fā)酵最有利。當豆餅水解液濃度為2%時，菌體干重和L-纈氨酸產(chǎn)量明顯偏低，同時糖酸轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度也較低。隨著豆餅水解液濃度增加，各參數(shù)也相應(yīng)增加，但當濃度提高至5%時，最終菌體干重和L-纈氨酸產(chǎn)量反而有所降低。由于豆餅水解液中含有XV0505菌株所必須的生長因子和各種氨基酸，若添加量不足，會影響菌體的正常生長，進而影響產(chǎn)量;添加過量，會導致前期菌體生長過快，造成后期活力不足，菌體生產(chǎn)能力降低，不利產(chǎn)酸。

2.2.2 不同硫酸銨濃度對L-纈氨酸的分批補料發(fā)酵的影響

用5L發(fā)酵罐進行分批補料發(fā)酵，分別添加150、225、300 和 375 mmol硫酸銨(NH4+)，從菌體生物量、產(chǎn)酸量、耗糖速率、糖酸轉(zhuǎn)化率和單位菌體生產(chǎn)強度5個方面定量分析了不同硫酸銨濃度對XV0505發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的影響，以及菌體對氮源的利用能力和需求情況，為進一步的氮源優(yōu)化提供依據(jù)。結(jié)果見圖1。

圖1 不同初始(NH4)2SO4濃度對黃色短桿菌XV0505發(fā)酵L-纈氨酸的影響

由圖 1可知，在整個發(fā)酵過程中，初始(NH4)2SO4濃度較低(75 mmol/L)時的菌體生長速率最高，耗糖較多，但L-纈氨酸的合成速率明顯偏低，產(chǎn)量偏低，糖酸轉(zhuǎn)化率和單位細胞生產(chǎn)強度均較低。隨著氮源濃度的增加，菌體生物量增加，耗糖量較多，產(chǎn)量明顯提高，糖酸轉(zhuǎn)化率和單位細胞生產(chǎn)強度有所提高，當初始(NH4)2SO4濃度為225 mmol/L時，發(fā)酵效果最好，纈氨酸產(chǎn)量可達到55.19 g/L。而當初始(NH4)2SO4濃度為375 mmol/L時菌體生長受到抑制，菌體總生物量明顯偏低，產(chǎn)酸量和耗糖量均較少，相對糖酸轉(zhuǎn)化率和單位細胞生產(chǎn)強度也處于一個較低的水平。

綜合以上結(jié)果可知，氮源初始濃度在發(fā)酵前期對菌體生長很重要，初始氮源濃度過高或過低都不利L-纈氨酸的合成。初始氮源濃度偏低時，雖有利菌體生長速率的提高和菌體量的增長，但過高菌體量導致進入產(chǎn)酸期時菌體的葡萄糖消耗速率偏低，菌體增長無力，活力不足，而且前期過高的菌體量導致發(fā)酵液粘度大，影響氧供應(yīng)，產(chǎn)酸水平低［4］;而且氮源不足，無法為纈氨酸的合成提供足夠的氨基。過高濃度的氮源在菌體快速生長期會抑制菌體生長，導致菌體量偏低;且高濃度的氮源在發(fā)酵前期產(chǎn)生的阻遏效應(yīng)難以解除，導致產(chǎn)酸期菌體對NH4+的同化利用減少，無法提供足夠氨基;另外，NH4+水平過高，還抑制菌體對葡萄糖的利用，降低發(fā)酵過程葡萄糖消耗速率，致使整個代謝途徑碳架流量缺少［5］?？梢?，較低初始氮源濃度對L-纈氨酸發(fā)酵有利，但是隨著氮源的消耗，會導致產(chǎn)酸期氮源濃度的不足，而且引起碳氮比的失衡，不利發(fā)酵的正常進行，因此，在較低初始氮源濃度的前提下，在產(chǎn)酸期進行一定氮源的添加，既可以有效解除高濃度的氮源對于菌體生長的抑制作用，又可以維持發(fā)酵過程中菌體產(chǎn)酸所需的氮源，有利于提高發(fā)酵強度和產(chǎn)酸水平。

2.3 氮源補加策略對L-纈氨酸發(fā)酵的影響

2.3.1 分批間歇流加補氮策略對L-纈氨酸分批補料發(fā)酵的影響

分批間歇流加氮源策略屬于非反饋控制策略，它既可解決發(fā)酵過程中氮源耗竭和副產(chǎn)物積累等問題，又可滿足菌體對氮源的需求。利用30 L發(fā)酵罐進行分批補料發(fā)酵考察3種分批間歇補加氮源策略對L-纈氨酸發(fā)酵的影響。當發(fā)酵體系剩余的氮源濃度為50 mmol/L左右時(約36 h)開始補加，策略Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別為每12 h、6 h、3 h補加 20 mL(NH4)2SO4。添加的(NH4)2SO4溶液濃度為264 g/L(每10 mL(NH4)2SO4溶液含有20 mmol/L NH4+)。發(fā)酵至60 h結(jié)束，其發(fā)酵過程曲線見圖2。

圖2 分批間歇流加氮源策略對XV0505發(fā)酵合成L-纈氨酸的影響

由圖2可知，在發(fā)酵過程中，氮源添加的間隔越大，發(fā)酵體系中氮源濃度也就越高，菌體生長和產(chǎn)酸也就受到抑制，而且葡萄糖消耗量越大，導致副酸產(chǎn)量增大，糖酸轉(zhuǎn)化率較低。氮源添加策略Ⅲ產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率最高，分別達到57.08 g/L和23.03%，可見間歇流加氮源應(yīng)是時間間隔越小對發(fā)酵越有利，而且主要副酸含量也會降低。當菌體生長進入穩(wěn)定期后，耗氨速度減慢，此時一次性補入少量NH4+可刺激產(chǎn)酸;若一次性補入過多NH4+，發(fā)酵體系中過高的NH4

+濃度會影響物質(zhì)代謝特征、物質(zhì)傳遞體系中關(guān)鍵酶酶活和菌體內(nèi)某些成分的生成，從而抑制菌體生長和產(chǎn)酸，且導致副產(chǎn)物積累［6－7］。因此，在總的氮源添加量相同的情況下，按照添加策略Ⅲ采多次少量分批補加氮源、維持較低濃度氮源的補氮方式，可解除了高濃度氮源對菌體生長和L-纈氨酸合成的抑制作用，又能維持了發(fā)酵中后期發(fā)酵體系中一定的氮源濃度，達到較好的發(fā)酵效果。

2.3.2 恒氮源維持濃度補氮策略對L-纈氨酸分批補料發(fā)酵的影響

研究表明，在菌體快速生長期和L-纈氨酸快速合成期這兩個階段，XV0505對氮源濃度的需求有差異。維持產(chǎn)酸期發(fā)酵過程中合適的氮源濃度可有效控制菌體比生長速率和L-纈氨酸的比合成速率，有效提高L-纈氨酸產(chǎn)量。前期研究表明，在L-纈氨酸快速合成期將碳氮比維持在14∶1～17∶1范圍內(nèi)時菌體生長和產(chǎn)酸效果最好，經(jīng)過計算，最佳氮源濃度范圍在24.9～38.1 mmol/L，而當碳氮比大于8∶1即氮源濃度大于62.5 mol/L時，菌體生長和產(chǎn)酸均受到強烈的抑制。恒氮源濃度補氮策略是一種簡單直接的反饋控制方法，在相同初始氮源濃度下，當?shù)礉舛冉抵烈欢ㄖ禃r，按時間間隔不斷取樣進行氮源濃度(銨濃度)的離線測定，用人控方法反饋調(diào)節(jié)相應(yīng)的補銨速率，將發(fā)酵體系中銨濃度維持在10 mmol/L、35 mmol/L、60 mmol/L，在30 L發(fā)酵罐上進行分批補料發(fā)酵，考察不同氮源維持濃度對L-纈氨酸發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 恒氮源維持濃度補氮策略對L-纈氨酸分批補料發(fā)酵的影響

由圖3可知，在菌體生長期，3種氮源維持濃度下各發(fā)酵參數(shù)均相差不大;而在產(chǎn)酸期，維持發(fā)酵體系中銨濃度為35 mmol/L時菌體生物量和產(chǎn)酸量均較高，L-纈氨酸的積累水平可提高到60.32 g/L。氮源維持濃度較高(60 mmol/L)時，發(fā)酵體系中NH+4濃度水平過高，抑制菌體對葡萄糖的利用，致使整個代謝途徑碳架流量缺少，L-纈氨酸合成量少［8］。氮源維持濃度較低(10 mmol/L)時，盡管菌體中L-纈氨酸合成酶系具有較好的酶活，由于銨離子的不足，α-酮戊二酸不能還原并氨基化，谷氨酸減少，無法為纈氨酸的合成提供足夠的氨基，轉(zhuǎn)氨基作用受阻，阻遏L-纈氨酸的合成;且在產(chǎn)酸明顯減少的情況下，葡萄糖消耗速率仍維持相對較高的水平，這是由于缺少氮源，菌體消耗的葡萄糖大部分參與了菌體基本生理代謝，而僅有小部分參與L-纈氨酸的合成，導致L-纈氨酸合成受阻，影響產(chǎn)量。

由以上可知，用反饋控制方法流加硫酸銨使發(fā)酵體系中銨濃度維持在35 mmol左右，既為L-纈氨酸合成途徑提供足夠的氨基，又有效解除了過高的濃度發(fā)酵過程產(chǎn)生的不利影響，而且還避免了濃度的大幅波動引起的發(fā)酵不穩(wěn)定性，使L-纈氨酸分批補料發(fā)酵到達較好的效果。

2.3.3 冪函數(shù)流加補氮策略對L-纈氨酸的分批補料發(fā)酵的影響

恒濃度反饋補氮策略使體系中氮源濃度按預設(shè)規(guī)律變化，能達到較高的發(fā)酵水平，但是需要人工頻繁的取樣和進行銨濃度離線測定，操作復雜，反饋滯后。因此，利用上述發(fā)酵條件下的四種流加速率變化進行曲線擬合，利用冪函數(shù)方程V=a·tb能較好地模擬發(fā)酵結(jié)果，其中，V是流加速率(mmol/h)，t為氮源流加時間(h)，a、b分別是方程參數(shù)。在一定發(fā)酵條件和濃度范圍內(nèi)，選擇表3中相應(yīng)的a、b值。在相同初始氮源濃度下進行L-纈氨酸的分批補料發(fā)酵，利用相應(yīng)的冪函數(shù)方程隨時間間隔控制硫酸銨的流加速率，將氮源濃度控制在35 mmol/L左右，發(fā)酵過程分析見圖4。

表3 維持恒氮源濃度補料過程的冪函數(shù)方程

圖4 冪函數(shù)補氮策略下L-纈氨酸分批補料發(fā)酵過程分析

從圖4可以看出，采用冪函數(shù)補氮策略能夠迅速及時調(diào)節(jié)銨離子補加速率，將銨濃度維持并穩(wěn)定在菌體生長和發(fā)酵的最佳濃度(35 mmol/L左右)下，此時，L-纈氨酸的發(fā)酵效果最好。與其余兩種補氮策略的最優(yōu)情況相比，L-纈氨酸的產(chǎn)量和菌體生物量都得到有效地提高，分別達到63.17 g/L和24.72 g/L;發(fā)酵液中主要副酸(如乳酸、蘇氨酸和丙氨酸)含量則相對較低，同時，糖酸轉(zhuǎn)化率可達24.69%。

3 討論與結(jié)論

前期相關(guān)研究表明，黃色短桿菌XV0505發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的過程屬于半耦合型，即菌體生長與產(chǎn)酸有一定聯(lián)系。在菌體生長階段中提高菌體的生長密度，后一階段強化L-纈氨酸的合成，將有助于提高整個發(fā)酵過程中L-纈氨酸的產(chǎn)酸水平［9］。合適的氮源及最佳初始添加濃度，對提高菌體生物量具有積極意義;而在產(chǎn)酸期補加一定量銨離子維持一定的碳氮比，有效保持菌體量的同時，還可為L-纈氨酸的合成提供足夠氨基，強化目標產(chǎn)物的合成，提高產(chǎn)量。

黃色短桿菌XV0505可利用多種氮源促進菌體生長和合成L-纈氨酸，經(jīng)搖瓶發(fā)酵驗證，確定豆餅水解液和硫酸銨為最佳氮源。另外，研究了不同初始氮源濃度對L-纈氨酸發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度氮源對菌體生長和產(chǎn)物合成有抑制作用;氮源濃度過低則抑制菌體產(chǎn)酸。且由前期代謝流量分析表明［10］，在產(chǎn)酸期，初始氮源濃度過低或過高時，菌體內(nèi)HMP途徑受到抑制，流量較小，無法提供菌體生長所需要的戊糖和核酸等物質(zhì)，而且產(chǎn)生的還原力NADPH較少，致使產(chǎn)酸受阻［11］;且TCA循環(huán)的流量相對較大，使得進入丙酮酸-纈氨酸合成途徑的流量較少，導致L-纈氨酸合成速率也較小。因此，較低的初始氮源濃度對發(fā)酵最為有利，但隨著氮源消耗碳氮比失衡，此時在維持一定葡萄糖濃度的同時也要補加一定氮源。由于NH4

+濃度的測定復雜且滯后，根據(jù)冪函數(shù)方程調(diào)節(jié)補氮速率，可將NH4+濃度控制在相應(yīng)的恒定值，從而減少頻繁的取樣和離線測定，將較復雜的反饋型控制轉(zhuǎn)化為較簡單的非反饋型控制。在缺乏良好的在線監(jiān)測系統(tǒng)和反饋自控系統(tǒng)的情況下，冪函數(shù)補氮策略近似的達到銨濃度的控制要求，可以實現(xiàn)氮源的限制培養(yǎng)，有效解除過高或過低氮源對發(fā)酵的不利影響，降低副產(chǎn)物的含量，提高糖酸轉(zhuǎn)化率，為優(yōu)化L-纈氨酸的生產(chǎn)提供有利的依據(jù)。

參考文獻

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The Effect of Nitrogen Sources and Its Additional Strategies on L-valine Fermentation by Brevibacterium flavum XV0505

Feng Ning，Bai Ya-lei，Xu Qing-yang，Xie Xi-xian，Chen Ning
(College of Biotechnology，Tianjin University of Science＆ Technology，Tianjin 300457，China)

By analyzing the L-valine fermentation process by Brevibacterium flavum XV0505，one of important factors influenced on the bacterial productivity and L-valine yield is nitrogen source and its additional strategies.The effect of nitrogen sources on the fermentation of L-valine was studied by adding different nitrogen sources with different concentrations.Therefore，soybean hydrolysates and ammonium sulfate were selected as the appropriate nitrogen source，and the best L-valine yield was obtained with the medium supplemented low initial concentration of 225 mmol/L.In the case of the same initial nitrogen concentration，the effects of three nitrogen feeding strategies(intermittent nitrogen feeding，constant concentration feeding and power function feeding)on biomass，yield of L-valine，concentration of byproduct and conversion rate were studied in the 30L fermentor.The result showed that the concentration and the feed rate of nitrogen source were effectively and timely manipulated by power function feeding，while lacking of online monitoring and feedback controlled system.The yield of L-valine was further improved up to 63.17 g/L by power function feeding strategy with the conversion rate of 24.69%.

L-valine，nitrogen sources，additional strategies，power function，brevibacterium flavum

碩士研究生(陳寧教授為通訊作者)。

*國家科技重大專項課題“企業(yè)新藥物孵化基地建設(shè)”(2008ZX09401-05);天津市科技支撐計劃重點項目(08ZCKFSH01900);天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃(08JCZDJC15400)

2010－11－22，改回日期:2010－12－23