黃雪松，陳磊

(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州，510632)

不同黃酒部位的沉淀蛋白質氨基酸組成分析*

黃雪松，陳磊

(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州，510632)

為分析黃酒混濁與沉淀的原因，采用硅溶膠吸附分離法獲得黃酒酒液和酒腳中易引起沉淀的蛋白，并一起分析測定這2個樣品和酒腳的氨基酸組成。結果表明:酒液沉淀蛋白的主要氨基酸為谷氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸，相對含量分別為41.33%、18.66%和9.56%;酒腳沉淀蛋白中主要氨基酸為谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸，分別為12.39%、11.32%和8.02%;酒腳中主要氨基酸為谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸，分別為16.57%、10.91%、7.14%。該結果顯示黃酒所含醇溶蛋白質中的谷氨酸導致黃酒混濁、沉淀現象的主要氨基酸。

黃酒，沉淀，蛋白，氨基酸

黃酒(Chinese rice wine)，釀造歷史悠久，營養(yǎng)豐富、滋味獨特 ，被譽為“國酒”，但在貨架期內存在著失光、混濁、沉淀等現象。這些沉淀雖然對人體無害，但嚴重影響黃酒的外觀品質。人們對于黃酒中的混濁沉淀成分及其形成機理進行了大量探索，不僅對其中的蛋白質含量和分子量進行了測定［1－3］，還對其他共存物如糖、多酚、金屬離子以及它們在酒液和酒腳(即黃酒沉淀物)含量的變化等進行了大量研究［4－5］。除明確的草酸鈣沉淀外［6］，到目前仍無確定結論說明黃酒中沉淀的成因及其主要影響因素。因此，盡管相關學者和很多黃酒生產技術人員對黃酒的澄清做了大量嘗試［7－8］，混濁沉淀問題仍未得到有效解決，這可能與至今未能確定組成沉淀蛋白質的種類及其相關的理化性質有關。但獲得各種高純度的黃酒混濁、沉淀蛋白質，并研究其理化性質、進而揭示其混濁、沉淀機理，這是一項系統、復雜、繁重的任務。本文對黃酒沉淀蛋白進行提取分離，測定其總的氨基酸組成，為黃酒蛋白沉淀機理研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和設備

黃酒購自浙江某上市公司(50kg壇裝，1年期)。硅溶膠，(NH4)2SO4，氨水，NH4HCO3。

紅外吸收光譜儀(EQUINOX 55)，德國Bruker公司，氨基酸分析儀(Hitachi)，日本日立公司;氣相色譜質譜聯用儀(Shimadzu QP2010)，日本;LC－20AT高效液相色譜儀(Shimadzu)，日本;光電二極管陣列檢測器(SPD－M20A，Shimadzu)，日本;色譜工作站(Class－vp;紫外可見分光光度計(SC－53)，上海棱光技術有限公司;旋轉蒸發(fā)器(RE－52 AAB)，上海嘉鵬科技有限公司;FD－1冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;KDC－1044低速離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公。

1.2 沉淀蛋白樣品的制備

1.2.1 酒液沉淀蛋白(樣品A)

將25 L的黃酒開壇后取20 L按4 mL/L的比例加入酸性硅溶膠，反復振蕩搖勻，放置24 h待其沉降完全，收集沉淀物，用蒸餾水將沉降物反復水洗3次除去酒精;以2%的氨水溶解沉降物，然后用25%飽和度的(NH4)2SO4鹽析，4℃過夜，待鹽析完全，于3 800 r/min離心10 min，用25%飽和度的(NH4)2SO4洗滌3次，于相同條件下離心，取沉淀;將沉淀用3 000 u的透析袋于4℃透析24 h脫鹽，脫鹽后的樣品在－80℃冷凍24 h后于真空冷凍干燥機中凍干得1.206 g樣品，此即為樣品A。

1.2.2 酒腳沉淀蛋白(樣品B)和酒腳(樣品C)

開壇得到的酒腳以3 800 r/min離心20 min，將沉淀用蒸餾水洗3次，相同條件離心取沉淀，平均分為2部分，其中1份以2%的氨水溶解，然后用25%飽和度的(NH4)2SO4鹽析，4℃12 h，待鹽析完全，于3 800 r/min離心10 min，用25%的(NH4)2SO4洗滌3次，于相同條件下離心，取沉淀;將沉淀用3000 u的透析袋于4℃透析24 h脫鹽，脫鹽后的樣品在－80℃冷凍24 h后于真空冷凍干燥機中凍干得2.502 g樣品，此為樣品B;另1份直接冷凍干燥，得25.387 g樣品，此為樣品C。

水解氨基酸的測定。(1)水解:準確稱取10.0～20.0 mg樣品放于水解管中，在水解管內加入10.0 mL濃度6 mol/L的HCl，加入新蒸餾的苯酚3～4滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min，再抽真空(接近0 Pa)，然后充入高純氮氣;再抽真空充氮氣，重復3次后，在充氮氣狀態(tài)下封口，并將其放在(110±1)℃的恒溫干燥箱內，水解22 h，取出冷卻。打開水解管，將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉移到50 mL容量瓶內，用去離子水定容。吸取濾液1 mL于5 mL容量瓶內，用真空干燥器在40～50℃干燥，殘留物用1～2 mL去離子水溶解，再干燥，反復進行兩次，最后蒸干，用1 mL pH 2.2的緩沖液溶解，供儀器測定用。(2)測定:準確吸取0.200 mL混合氨基酸標準，用pH 2.2的緩沖液稀釋到5 mL，此標準稀釋液濃度為100 μmol/L，作為上機測定用的氨基酸標準，用氨基酸自動分析儀以茚三酮柱后衍生法分別在570 nm和440 nm測定試樣中氨基酸含量，色譜柱為日立855－350型，柱溫57℃，反應柱溫134℃，進樣量20 μL，測定時間59 min。以外標單點矯正法定量試樣測定液中的氨基酸。

2 結果與分析

2.1 標準氨基酸分析

圖1顯示了混合氨基酸標準溶液分離效果，由圖1a可看出570 nm下16種氨基酸分離效果良好，而在440 nm下，脯氨酸的分離效果也較為理想(圖1b)，可以滿足分離、定量的要求。

圖1 標準氨基酸分離圖譜

2.2 樣品中氨基酸的分析

由圖2可以看出，3個樣品的水解液中氨基酸的分離效果良好。

圖2 樣品中氨基酸分離圖譜

計算樣品中氨基酸含量后發(fā)現(表1)，酒液沉淀蛋白(A)中水解氨基酸總含量最低，僅為5.493%，這說明硅膠從酒液中所吸附下來的成分中，其蛋白并不是主要成分;通過堿溶鹽析所得的酒腳沉淀蛋白(B)中水解氨基酸總含量最高，為43.665%;酒腳(C)中水解氨基酸總含量為28.095%;由于酒腳樣品未經其他處理，且易吸潮，可推斷其中含有一定量的糖類部分。同時，由圖2可看出，3個樣品中均含有較高量的NH3，其主要來源為樣品的水解，這也是造成所測樣品中蛋白含量較低的原因之一。

表1 三個樣品中水解氨基酸的種類及含量

通過比較3個樣品中水解氨基酸的相對含量(圖3)可知，酒液沉淀蛋白(A)中的主要氨基酸為谷氨酸，占其氨基酸總量的41.33%，其次為脯氨酸和苯丙氨酸，分別占18.66%和9.56%;酒腳沉淀蛋白(B)中含量最高的為谷氨酸(12.39%)，其次是天門冬氨酸(11.32%)和亮氨酸(8.02%);酒腳(C)中含量最高的也是谷氨酸(16.57%)，然后是天門冬氨酸(10.91%)和亮氨酸(7.14%)。總之，3個樣品中，谷氨酸的含量是最高的，這意味著黃酒蛋白中的谷氨酸可能對黃酒的混濁與沉淀有重要影響。

圖3 三個樣品中水解氨基酸的相對含量

谷氨酸在黃酒主要原料小麥所含蛋白質，即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白中的含量分別為:16%，16.0%，32.4%，22.7%［8］，即醇溶蛋白中的谷氨酸含量最高。與樣品A中谷氨酸含量(41.33%)相比稍低，但據此仍然可以認為:樣品A主要含有醇蛋白，即引起黃酒混濁沉淀的蛋白質主要為酸性的醇溶蛋白。至于兩個谷氨酸含量的差異，估計與醇溶蛋白的親水部分被水解有關。

黃酒混濁、沉淀蛋白質與啤酒沉淀蛋白不同，黃酒沉淀蛋白質主要含有谷氨酸，而啤酒沉淀蛋白主要含有脯氨酸［10－12］，這表明引起黃酒中的沉淀原因和機理與啤酒不同。啤酒沉淀(與混濁)蛋白水解物中的脯氨酸含量是最高的，人們據此認為蛋白多酚沉淀主要是脯氨酸與多酚之間的結合造成的。而黃酒沉淀蛋白主要與其所含醇溶蛋白有關。

根據本文與有關文獻實驗數據分析認為:醇溶蛋白是引起黃酒混濁沉淀的，這一結論與實際情況也是一致的。例如隨著貯存時間的延長，pH值常常下降，這樣會引起主要由酸性氨基酸組成的醇溶蛋白疏水性的增強，因而導致沉淀現象發(fā)生;另外，當貯存溫度降低時，醇溶蛋白在黃酒中的溶解度也是降低的，也會引起黃酒的混濁沉淀現象。至于其詳細的混濁、沉淀機制，還有待進一步研究。

［1］ 楊國軍，俞關松，尉冬青.黃酒中蛋白質分布、含量與酒質穩(wěn)定性的研究［J］.釀酒科技，2005(7):68－70.

［2］ 陳云萍，熊建生.黃酒穩(wěn)定性技術的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1989(2):11－16.

［3］ 謝廣發(fā)，孟中法，周建弟.黃酒蛋白質的測定及其沉淀原因探討［J］.釀酒科技，2002(3):64－68.

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［5］ 江超，林峰，鄒慧君等.陳年紹興黃酒的成分分析與品質鑒定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(10):119－123.

［6］ 謝廣發(fā)，沈斌，胡志明等.黃酒中的另一種沉淀——草酸鈣沉淀［J］.釀酒，2011，38(3):26－28.

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Components of Amino Acids of Haze Protein from the Different Setting Fraction in Chinese Rice Wine

Huang Xue-song，Cheng Lei
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

To investigate the causes of turbidity and sedimentation in Chinese rice wine，haze proteins were obtained through the absorbing effects in the rice wine and precipitate.The hydrolysis amino acids of both the haze proteins and the precipitate were analyzed by amino acid auto－analyzer.The results show that the haze protein in rice wine is composed mainly of glutamic(41.33%)，proline(18.66%)and phenylalanine(9.56%)，haze protein in the precipitate is composed of luctamic(12.39%)，aspartic(11.32%)and leucine(8.02%)and those in the precipitate is composed of glutamic(16.57%)，aspartic(10.91%)and leucine(7.14%).A conclusion can be drawn that glutamic acid is the main amino acid of haze proteins that caused the turbidity and sedimentation of rice wine.Key words rice wine，precipitate，haze protein，amino acid

博士，教授。

*廣東省產學研科技項目(2011B0980400452)資助

2011－03－19，改回日期:2011－09－01