王濤，田時(shí)平，趙東，游玲，王松，馮瑞章，馮學(xué)愚，張?jiān)?，崔曉?/p>

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓，644000)2(發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓，644000)3(云南大學(xué)省微生物研究所，云南，昆明，650091)4(五糧液股份公司，四川宜賓，644000)

宜賓濃香型白酒窖泥中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性*

王濤1，2，田時(shí)平3，趙東4，游玲2，王松1，2，馮瑞章1，2，馮學(xué)愚2，張?jiān)?，崔曉龍3

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓，644000)2(發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓，644000)3(云南大學(xué)省微生物研究所，云南，昆明，650091)4(五糧液股份公司，四川宜賓，644000)

采用純培養(yǎng)和免培養(yǎng)(culture-independent)分析方法，對(duì)宜賓多家規(guī)模以上白酒企業(yè)成熟窖泥細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究。采用改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)和高氏I號(hào)分離培養(yǎng)基分離細(xì)菌(包括放線菌)，并評(píng)價(jià)菌株的乙醇耐受能力和低pH耐受能力。構(gòu)建了窖泥樣品總DNA的16S rRNA基因克隆文庫(kù)。分別挑選不同培養(yǎng)特征的89株細(xì)菌純培養(yǎng)物和427個(gè)基因克隆的16S rRNA基因序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。89株純培養(yǎng)物分屬于13個(gè)屬，以Streptomyces(39株)和Bacillus(27株)為優(yōu)勢(shì)屬。純培養(yǎng)菌株中，具備7%濃度乙醇耐受能力和低pH(4.5)耐受能力的分別有16株和10株。挑取的克隆子經(jīng)測(cè)序、去除嵌合體后，得到了406個(gè)有效序列，并在97%的序列相似性水平上可將其分為75個(gè) OTU(Operational Taxonomic Unit)，分屬于 Clostridia、Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Deinococci、Planctomycea、Bacteroidia 8 個(gè)綱。其中 Clostridia 為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，包含50個(gè)OTU、227個(gè)克隆子;Bacilli包含11個(gè)OTU、128個(gè)克隆子，為次優(yōu)勢(shì)菌群。證明宜賓濃香型白酒窖泥中細(xì)菌群落存在豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性。

濃香型白酒，窖泥，細(xì)菌，16S rRNA基因，系統(tǒng)發(fā)育多樣性

以固態(tài)泥池(窖池)發(fā)酵為典型特征的濃香型白酒是我國(guó)特有的傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，其產(chǎn)量和收入均占到了我國(guó)白酒產(chǎn)業(yè)的70%以上。長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐表明，窖池泥土(窖泥)中復(fù)雜的微生物群落與濃香型白酒中復(fù)雜的呈香呈味物質(zhì)形成直接相關(guān)，與產(chǎn)品質(zhì)量和酒體風(fēng)格有著十分密切的關(guān)系［1］。在濃香型白酒生產(chǎn)中，糟醅在窖池內(nèi)發(fā)酵周期長(zhǎng)達(dá)60 d以上。通常情況下，發(fā)酵2～3周后，窖池內(nèi)就處于厭氧狀態(tài)，乙醇濃度達(dá)到5% ～6%及以上，pH值緩慢下降到3～4［2］。在長(zhǎng)期不間斷的生產(chǎn)中，窖泥一直處于相對(duì)穩(wěn)定和特殊的生態(tài)環(huán)境中，其中的微生群落在持續(xù)且相對(duì)穩(wěn)定選擇壓下可能逐漸趨于穩(wěn)定且具備一定的特殊性。

目前對(duì)濃香型白酒窖泥微生物的研究主要涉及微生物群落組成及其變化規(guī)律、功能微生物的分離及應(yīng)用等［3－5］。盡管通過(guò)這些研究初步認(rèn)識(shí)了窖泥微生物群落，獲得了一些有用的菌株并已應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，但這些研究均存在采集的樣品較少(僅采集了一個(gè)酒廠的窖泥)、研究手段單一(僅采用了純培養(yǎng)研究方法)、研究不夠深入(許多研究?jī)H對(duì)窖泥微生物開展了表觀形態(tài)和菌落計(jì)數(shù)研究)等問(wèn)題。宜賓為中國(guó)優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的主要產(chǎn)區(qū)，對(duì)宜賓窖泥微生物群落開展系統(tǒng)的研究，既有利于指導(dǎo)行業(yè)穩(wěn)定及提高產(chǎn)品質(zhì)量，提高出酒率，還有利于進(jìn)一步正確認(rèn)識(shí)濃香型白酒發(fā)酵機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

采集了宜賓6家規(guī)模以上濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)多口窖的窖泥，采樣時(shí)間為2008年3～4月。取樣窖池使用年限均在20年以上，每口窖取窖壁上、中、下層各4點(diǎn)(4面窖壁)及窖底中央窖泥各100g，每個(gè)企業(yè)窖泥樣品單獨(dú)混合。

1.2 分離

采用改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)分離細(xì)菌、改良的高氏I號(hào)培養(yǎng)基分離放線菌。定期觀察分離平板，挑取單菌落劃線純化于常規(guī)NA或高氏I號(hào)斜面上。根據(jù)菌落的顏色、大小、突起特征、邊緣特征、表面光滑與否和透明度等肉眼可辯的特征去除冗余。

1.3 菌株16S rRNA基因分析

1.3.1 DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)文獻(xiàn)［6］適當(dāng)修改，提取菌株基因組DNA、擴(kuò)增出16S rRNA基因片段。引物27f:5'－AGAGTTT-GATCTGGCTCAG－3'和1541 r:5'－AAGGAGGTGATC CAGCCGCA － 3'［7］。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)純化并測(cè)序，測(cè)序長(zhǎng)度700－900 bp，序列已在GenBank注冊(cè)。

1.3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

所得序列用EzTaxon server 2.0［8］在線進(jìn)行相似性分析，對(duì)克隆的16S rRNA基因序列還采用Blast進(jìn)行相似性分析。用ClustalX按照最大同源性的原則進(jìn)行比對(duì)，并用BioEdit 5.0.9進(jìn)行檢驗(yàn);采用Mega 4.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(neighbour－joining tree)的構(gòu)建、編輯與保存，序列相似值選用Kimura－2［9］計(jì)算，自舉值(bootstrap value)分析設(shè)置1000個(gè)數(shù)據(jù)樣本［10］。對(duì)聚在一條直線的菌株，通過(guò)ClustalX比對(duì)確定其序列相似度為100%后，合并成一個(gè)類群。

1.4 菌株對(duì)乙醇和低pH值耐受能力

參照文獻(xiàn)［11］的方法適當(dāng)修改，檢測(cè)菌株在7%的乙醇(V/V)和pH 4.5環(huán)境下的耐受能力。

1.5 克隆文庫(kù)構(gòu)建及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.5.1 窖泥總DNA提取和16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增

采用文獻(xiàn)［12］方法適當(dāng)改進(jìn)，采用試劑盒(GENECLEAN Turbo Kits)進(jìn)行DNA純化。采用與純培養(yǎng)菌株一樣的引物，將在各個(gè)退火溫度下(52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃)擴(kuò)增的產(chǎn)物混合后用多功能純化回收試劑盒(百泰克)純化。

1.5.2 PCR產(chǎn)物克隆

用氯化鈣法制備感受態(tài)大腸桿菌，利用pMD○R19-T Vector試劑盒(寶生物)，得到PCR產(chǎn)物克隆。

1.5.3 重組子篩選及測(cè)序

用引物M13f和M13r進(jìn)行插入的16S rDNA片段檢測(cè)后，陽(yáng)性克隆子送往上海生物工程有限公司(Sangon)測(cè)序。運(yùn)用Mallard［13］軟件進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)并去除嵌合體后，使用DOTUR1.53［14］軟件把序列相似性大于97%的序列劃分為同一個(gè)OTU(Operational Taxonomic Unit)［15］，并利用 Analytic Rarefaction Win v.1.3軟件(S.Holland，Stratigraphy Lab，University of Georgia，Athens;www.uga.edu/～ strata/software/)繪制稀有性曲線，根據(jù)文庫(kù)的Coverage C值確定是否補(bǔ)充克隆子測(cè)序。

1.5.4 序列相似性檢索

每個(gè)OTU隨機(jī)選擇1個(gè)代表序列分別通過(guò)EzT-axon server 2.0［8］和 Blast軟件在線與典型菌株16S rRNA基因和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知有效序列進(jìn)行比對(duì)進(jìn)行相似性分析。與“1.3.2”部分相同的方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性

經(jīng)過(guò)菌落和細(xì)胞形態(tài)表觀去除冗余后，得到89株純培養(yǎng)菌株。對(duì)其進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序后，經(jīng)序列比對(duì)、相似性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析(表1，圖1)，發(fā)現(xiàn)89株菌與13個(gè)屬的38個(gè)種的典型菌株(未列出)序列相似性大于97%。89株菌中，屬于Streptomyces的菌株最多(39株)，其次為Bacillus(27株)，它們占到了菌株總數(shù)的74.2%。其余各屬菌株均在4株及以下，有4個(gè)屬僅分離到1株菌。

表1 純培養(yǎng)菌株的16S rRNA基因相似性分析及乙醇、pH 4.5耐受性檢測(cè)結(jié)果

89株細(xì)菌中，能夠在含有體積分?jǐn)?shù)為7%乙醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株有16株(Bacillus 15株、Brevibacterium 1株);能夠耐受pH值為4.5的培養(yǎng)基的細(xì)菌有10株(Streptomyces 7株、Bacillus 3株)。其中，只有 1株與 Bacillus cereus典型菌株(ATCC 14579)16S rRNA基因相似度達(dá)99.5%的兼性厭氧菌既能耐受7%濃度的乙醇，又能耐受pH 4.5。

圖1 89株細(xì)菌與相關(guān)典型菌株構(gòu)建的基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 免培養(yǎng)法分析細(xì)菌的多樣性

共測(cè)定了427個(gè)克隆，經(jīng)檢測(cè)去除21個(gè)嵌合體序列后，406條有效序列在97%的相似度上劃分為75個(gè)OTU，文庫(kù)的Coverage C達(dá)到93.3%(文庫(kù)的稀有性曲線如圖2)，表明這些克隆代表了文庫(kù)中絕大多數(shù)細(xì)菌微生物的多樣性。EzTaxon server 2.0和Blast軟件相似性比對(duì)的結(jié)果如表2、表3(為顯示清晰，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育信息對(duì)OTU進(jìn)行了重新歸類)，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。

相似性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，75個(gè)OTU分屬于Clostridia、Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、Deinococci、Planctomycea、Bacteroidia 8個(gè)綱。其中Clostridia為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，包含50個(gè)OTU、227個(gè)克隆子(表2)，分別占OTU總數(shù)和克隆子總數(shù)的66.7%和55.9%。Bacilli包含11個(gè)OTU、128個(gè)克隆子，分別占14.7%和31.5%。其余的6個(gè)綱分別占OTU和克隆子總數(shù)的12.0%(9個(gè)OTU)和12.56%(51個(gè)克隆)(具體情況見(jiàn)表3)。所以從綱(Class)一級(jí)分類單位來(lái)看，Clostridia和Bacilli為優(yōu)勢(shì)菌群，且優(yōu)勢(shì)明顯。

圖2 窖泥細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫(kù)的稀缺性曲線

表2 1 50個(gè)屬于Clostridia的OTU及其16S rRNA基因序列EzTaxon和BLAST相似性分析結(jié)果

續(xù)表2

表3 屬于Clostridia以外7個(gè)綱的25個(gè)OTU及其16S rRNA基因序列EzTaxon和BLAST相似性分析結(jié)果

有26個(gè)OTU(231個(gè)克隆，占克隆總數(shù)的56.90%)的代表序列與對(duì)應(yīng)的典型菌株16S rRNA基因的相似度在97%以上，其中包含克隆數(shù)量處于前2位且顯著多于其他OTU的YJN51(相似度99.6%，73個(gè)克隆)和YJN31(相似度97.4%，52個(gè)克隆)，這26個(gè)OTU中克隆所代表的微生物可初步判定為對(duì)應(yīng)屬的微生物［16－17］。其中屬于 Lactobacillus屬的克隆數(shù)最多(95)，其次為Clostridium(65)，其后依次是Serratia(21)、Bacillus(21)、Streptomyces(6)、Staphylococcus(4)、Weissella(4);Oceanobacillus、Alkalibaculum、Petrimonas、sulfuriphila、Propionibacterium、Rubellimicrobium和Acinetobacte各有2個(gè)克隆，Thermus、Rhizobium和Brevundimonas各有1個(gè)克隆。其他的克隆可能均可能代表新分類單位，而且有75個(gè)克隆(分屬于20個(gè)OTU)與最接近的典型菌株16S rRNA基因的相似性在90%以下(最低的僅82.1%)，且與數(shù)據(jù)庫(kù)中最接近的序列均為Uncultured bacterium clone的序列。所以，從能夠初步確定的17個(gè)屬一級(jí)分類單位來(lái)看，Lactobacillus和Clostridium占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還有176個(gè)克隆所代表的微生物代表著屬及以上分類單位的新類群。

圖3 窖泥中克隆序列與已知細(xì)菌相關(guān)序列構(gòu)建的16S基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本研究中，2種方法的研究結(jié)果都顯示宜賓濃香型窖泥中存在著豐富的細(xì)菌多樣性。純培養(yǎng)顯示的13個(gè)屬中，有5個(gè)屬(Rubellimicrobium、Staphylococcus、Streptomyces、Bacillus、Serratia)在免培養(yǎng)研究中被檢測(cè)到，而且盡管分屬于這5個(gè)屬的菌株高達(dá)76株(占分離菌株的84.40%)，但還有8個(gè)屬?zèng)]有在免培養(yǎng)分析結(jié)果中體現(xiàn)。而免培養(yǎng)所顯示的17個(gè)屬和大量的潛在新分類單位中，只有上述的5個(gè)屬(共54個(gè)克隆，占檢測(cè)克隆總數(shù)的13.35%)在純培養(yǎng)分析中被檢測(cè)到。其余的12個(gè)屬(含2個(gè)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬)和所有的潛在新分類單位(占檢測(cè)克隆總數(shù)的86.65%)沒(méi)有在純培養(yǎng)研究結(jié)果中體現(xiàn)。這些和純培養(yǎng)技術(shù)僅能獲得環(huán)境中極少一部分微生物［18］和免培養(yǎng)方法也存在一定的局限性［19］是吻合的。

純培養(yǎng)和免培養(yǎng)分析結(jié)果均顯示濃香型白酒窖池中存在抗逆性較強(qiáng)的芽孢(孢子)細(xì)菌，數(shù)量占絕了對(duì)優(yōu)勢(shì)。Clostridia和Bacilli 2綱中所有已知的菌株均可產(chǎn)生芽孢，而這2個(gè)綱的細(xì)菌共占了OTU總數(shù)的88.00%和克隆總數(shù)的87.44%;純培養(yǎng)菌株中，Bacillus、Lysinibacillus、Paenibacillus、Rummeliibacillus 4個(gè)屬(共37株菌)可以產(chǎn)生芽孢，數(shù)量最多的為可產(chǎn)生孢子的Streptomyces屬菌株(39株菌)。同時(shí)，純培養(yǎng)菌株中能夠在7%乙醇的培養(yǎng)基和pH 4.5的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株分別有16株和10株。這表明，在長(zhǎng)期不間斷生產(chǎn)所形成較高乙醇濃度、較低pH條件環(huán)境選擇下，窖泥中形成了主要種群能夠順利延續(xù)，從而保持群落相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)菌群落。

濃香型白酒的主體呈香呈味物質(zhì)為乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯(其中尤以己酸乙酯最為重要)，它們主要在厭氧條件下由有機(jī)酸在酯酶的催化下與乙醇生成［1］。屬一級(jí)分類單位中，優(yōu)勢(shì)屬Lactobacillus和Clostridium分別為兼性厭氧細(xì)菌和專性厭氧細(xì)菌，表明這2個(gè)屬的菌株有在后期厭氧條件下生長(zhǎng)繁殖的可能。Lactobacillus屬的菌株除了產(chǎn)生乳酸外，在一定條件下也會(huì)產(chǎn)生乙酸、丁酸、己酸等［20］及催化酯化反應(yīng)的酯酶［21］。而 Clostridium 屬的菌株幾乎都可以產(chǎn)生小分子有機(jī)酸。1945年就已經(jīng)報(bào)道1株Clostridium kluyveri能夠在厭氧條件下產(chǎn)生己酸、丁酸和乙酸［22］，隨后大量Clostridium屬的菌株被報(bào)道能夠產(chǎn)生包含己酸在內(nèi)的上述4種有機(jī)酸［23－25］。而本研究中與 Clostridium kluyveri典型菌株序列相似性在97.4%的OTU包含了52個(gè)克隆，在所有OTU處于第2位。這些都顯示窖泥中的主要細(xì)菌類群可能與濃香型白酒的生產(chǎn)存在著密切的關(guān)系。

濃香型白酒窖泥中存在豐富的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，這個(gè)群落中的主要類群具備在窖泥特殊的生態(tài)環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖，從而保證其群落穩(wěn)定性的能力。由于濃香型白酒不同窖池之間、同一口窖池不同部位之間的微生物群存在較大差異，而且其中的微生物群落還會(huì)隨著不同季節(jié)和發(fā)酵的不同階段產(chǎn)生波動(dòng)，所以要全面揭示濃香型白酒窖泥中細(xì)菌群落的多樣性及其與濃香型白酒的生產(chǎn)的關(guān)系，需要更為全面的采集樣品、采用多種方法從不同側(cè)面開展系統(tǒng)的研究。

［1］ 李大和，黃圣明.濃香型曲酒生產(chǎn)技術(shù)［M］.北京:輕工業(yè)出版社，1991:95－107.

［2］ 張文學(xué)，岳元媛，向文良，等.濃香型白酒酒醅中化學(xué)物質(zhì)的變化及其規(guī)律性［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào):工程科學(xué)版，2005，37(7):44－ 48.

［3］ 王旭亮，王德良，韓興林，等.白酒微生物研究與應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.釀酒科技，2009(6):88－91.

［4］ 張霞，武志芳，張勝潮，等.貴州濃香型白酒窖池可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.釀酒科技，2010(12):23－27.

［5］ 汪江波，萬(wàn)朕，李莉，等.稻花香窖泥微生物群落變化研究［J］.釀酒科技，2010(11):26－39.

［6］ 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:353－358.

［7］ Rainey F A，Naomi W R，Kroppenstedt R M，et al.The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage:proposal of Nocardiopsaceae fam.nov.［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，1996，46:1 088－1 092.

［8］ Jongsik C，Jae-Hak L，Yoonyoung J，et al.EzTaxon:a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57:2 259－2 261.

［9］ Kimura M.A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences［J］.Journal of Molecular Evolution，1980，16:111－120.

［10］ Felsenstein，J.Confidence limits on phylogenies:an approach using the bootstrap［J］.Evolution，1985，39:783－791.

［11］ 劉從艾，穆文斌，徐懷玉，等.大曲酵母菌及窖泥生香菌耐酸能力的研究［J］.釀酒，1999(1):47－50.

［12］ 傅蓮英，席峰，袁建軍，等.海水養(yǎng)殖沉積環(huán)境微生物總DNA的提取方法研究［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2006，45(6):841－846.

［13］ Kevin E A，Nadia A C，John C F，wt al.New screening software shows that most recent large 16S rRNA gene clone libraries contain chimeras［J］.Applied and Enviro-mental Microbiology，2006，72(9):5 734－5 741.

［14］ Schloss P D，Handelsman J［J］.Introducing DOTUR，a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness［J］.Applied and Enviromental Microbiology，2005，71(3):1 501－1 506.

［15］ Mccaig A E，Glover L A，Prosser J I.Molecular analysis of bacterial community structure and diversity in unimproved and improved upland grass pastures［J］.Applied and Enviromental Microbiology，1999，65(4):1 721 －1 730.

［16］ Stackebrandt E，Ebers J.Taxonomic parameters revisited:tarnished gold standard［J］.Microbiology Today，2006，33:152－155.

［17］ Yarza P，Richter M，Peplies J，et al.The All-Species Living Tree project:a 16S rRNA-based phylogenetic tree of all sequenced type strains［J］.Systematic and Applied Microbiology，2008，31(4):241－250.

［18］ Miteva V I，Scheridant P P，Brenchley JE.Phylogenetic and physiological diversity of microorganisms isolated from a deep Greenland glacier ice core［J］.Applied and Enviromental Microbiology，2004，70(1):202–213.

［19］ Pearce D A，van der Gast C J，Lawley B，et al.Bacterioplankton community diversity in a maritime Antarctic lake，determined by culture-dependent and culture－independent techniques［J］.FEMS Microbiology Ecology，2003，45(1):59－70.

［20］ Corsetti A，Gobbetti M，Rossi J，et al.Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria:identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1998，509(2):253－256.

［21］ Noraini M.Khalid，Morsi El Soda，et al.Esterases of Lactobacillus helveticus andLactobacillus delbrueckii ssp.Bulgaricus［J］.Journal of Dairy Science，1990，73(10):2 711－2 719.

［22］ Barker HA，Kamen MD，Bornstein BT.The synthesis of butyric and caproic acids from ethanol and acetic acid by Clostridium kluyveri［J］.Proceedings of the National A-cademy of Sciences，1945，31(12):373–381.

［23］ Kenealy WR，Cao Y，Weimer PJ.Production of caproic acid by cocultures of ruminal cellulolytic bacteria and Clostridium kluyveri grown on cellulose and ethanol［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1995，44(3/4):507－513.

［24］ Jeon BS，Kim BC，Um Y，et al.Production of hexanoic acid from D-galactitol by a newly isolated Clostridium sp.BS － 1［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，88(5):1 161－1 167.

［25］ Andersch W，Bahl H and Gottschalk G.Level of enzymes involved in acetate，butyrate，acetone and butanol formation by Clostridium acetobutylicum［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1983，18(6):327－332.

Bacterial Diversity of Mud Samples from Fermentation Pits of Multi-grain Strong-flavor Liquor Factories in Yibin，Sichuan Province，China

Wang Tao1，2，Tian Shi-ping3，Zhao Dong4，You Lin2，Wang Song1，2，F(xiàn)eng Rui-zhang1，2，F(xiàn)eng Xue-yu2，Zhang Yun2，Cui Xiao-long3
1(College of Life Science＆ Food Engineering，Yibin University，Yibin 644000，China)2(Key Laboratory ofFermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province，Yibin University，Yibin 644000，China)3(Yunnan Institute of Microbiology，Yunnan University，Kunming 650091，China)4(Wuliangye Group Co.，Ltd.，Yibin 644000，China)

The aim of this study was to investigate bacterial diversity of mud samples from fermentation pits of multi-grain strong-flavor liquor factories in Yibin Sichuan province.We employed modified nutrient agar medium and Gogan-I medium for isolation and cultivation，and constructed 16S rRNA gene clone library with universal bacteriaspecific primers.Then the 16S rRNA gene sequences of the isolates and clones were analyzed，and the isolates were tested for capacity of ethanol and low-pH value tolerance.Eighty-nine strains with different culture characteristics and 427 clones from sample were selected for 16S rRNA gene sequences analysis.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences showed that the 89 strains belonged to 13 genera，and Streptomyces，Bacillus are dominant genera with 39 strains and 27 strains，respectively.Four hundred and six sequences of clones(21 chimeras wiped off)were defined into 75 operational taxonomic units(OTUs)according to the 97%similarity threshold for OTU assignment by the software program DOTUR.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences showed that these OTUs belonged to Clostridia，Bacilli，Actinobacteria，γ-Proteobacteria，α-Proteobacteria，Deinococci，Planctomycea，Bacteroidia.Clostridia and Bacilli are dominant classes with 50 OTUs(227 clones)and 11 OTUs(128 clones)，respectively.Sixteen and 10 strains of 89 strains showed the capacity of ethanol and low-pH value tolerance.Bacteria of fermentation pits mud present plentiful diversity.

Multi－grain strong－flavor liquor，Pit mud，bacteria，16S rRNA gene，phylogenetic diversity

碩士研究生。

*四川省科技廳支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008NZ0031，2010NZ0029，2010NZ0091);四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2009JY0149);四川省教育廳重大培育項(xiàng)目(09ZZ039);四川省屬高校白酒生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助;宜賓市科技專項(xiàng)研究項(xiàng)目(200805303、2010ZGY016)

2011－06－09，改回日期:2011－07－13