陳秋平 姜天甲 馬曉豐 沈建福

油茶蒲水提物的減肥作用

陳秋平1姜天甲1馬曉豐2沈建福1

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院1，杭州 310058)
(中國(guó)科學(xué)院研究生院生物系2，北京 100039)

脂肪酸合酶是治療肥胖癥的潛在靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)油茶蒲水提物對(duì)脂肪酸合酶有很強(qiáng)的可逆抑制和不可逆抑制作用，其對(duì)脂肪酸合酶的半抑制濃度僅為1．72μg/mL。在一個(gè)油茶蒲水提物濃度為25μg/mL的酶－抑制劑混合體系中，180 min后脂肪酸合酶的剩余活性不到30%。同時(shí)小鼠預(yù)防性肥胖試驗(yàn)結(jié)果顯示，300 mg/kg油茶蒲水提物能顯著降低小鼠的體重增加率、體脂比和肝臟的脂肪酸合酶活性，且作用效果強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照奧利司它。研究結(jié)果顯示，油茶蒲水提物具有作為控制肥胖的功能性成分開(kāi)發(fā)的潛力，這可能與其對(duì)脂肪酸合酶的抑制作用有關(guān)。

油茶蒲水提物 脂肪酸合酶 減肥 抑制劑

中國(guó)營(yíng)養(yǎng)和健康調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，14．7%的中國(guó)人體重超標(biāo)，2．6%的中國(guó)人屬于肥胖。中國(guó)肥胖的增長(zhǎng)速度令人擔(dān)憂，現(xiàn)在全球近1/5的體重超標(biāo)者或肥胖者是中國(guó)人［1］。脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase，F(xiàn)AS)，是催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成內(nèi)源性長(zhǎng)鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶［2］。研究證實(shí)FAS大量存在于許多常見(jiàn)人類的癌中，這種組織分布特異性使得FAS成為治療癌癥的一個(gè)引人注意的靶點(diǎn)［3］。Loftus等［4］通過(guò)給 ob基因缺陷型小鼠腹腔注射FAS抑制劑C75，發(fā)現(xiàn)小鼠體重顯著減輕，這種體重的減輕呈劑量依賴性，隨劑量的增加而延長(zhǎng)作用的時(shí)間，并且這種作用不依賴瘦素。因此，脂肪酸合酶可能成為治療肥胖癥和癌癥的雙重靶點(diǎn)，它的抑制劑的開(kāi)發(fā)成為研究的熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的脂肪酸合酶抑制劑非常少，淺藍(lán)菌素是最早被發(fā)現(xiàn)的抑制劑［5］，但是它具有一定的毒性，因此 Kuhajda 等［6］以它為模板，化學(xué)合成了新FAS抑制劑C75，它化學(xué)穩(wěn)定且無(wú)毒。

油茶(Camellia oleifera Abel)是山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)木本植物，是我國(guó)特有的油料樹(shù)種，目前中國(guó)油茶種植面積正逐年增加，油茶籽的產(chǎn)量也在逐步增長(zhǎng)。油茶蒲又稱茶包，為油茶果的外殼，是油茶生產(chǎn)的廢棄物，每年產(chǎn)量約有170多萬(wàn)噸。在油茶產(chǎn)區(qū)，油茶蒲或作為燃料或被丟棄，利用率極低［7］。研究發(fā)現(xiàn)油茶籽殼及油茶餅提取物對(duì)脂肪酸合酶具有很強(qiáng)的抑制作用［8］。本試驗(yàn)中的研究結(jié)果顯示，油茶蒲水提物對(duì)脂肪酸合酶的抑制作用是迄今報(bào)道的油茶來(lái)源中最強(qiáng)的，并且對(duì)高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠具有很好的預(yù)防肥胖效果。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑和儀器

油茶蒲:浙江省衢州市常山縣芳村鎮(zhèn)。

脂肪酸合酶:中科院研究生院酶學(xué)試驗(yàn)室;乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A和還原性輔酶Ⅱ(NADPH):美國(guó)sigma公司;二巰基蘇糖醇 (DTT):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;奧利司它(Orlistat):瑞士羅氏制藥廠生產(chǎn);其他化學(xué)試劑均為分析純。

試驗(yàn)動(dòng)物與飼料:ICR小鼠由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，雄性，體重(20±2)g，基礎(chǔ)飼料由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，營(yíng)養(yǎng)飼料的配方為蛋黃粉10%、豬油10%、普通飼料80%。

TU－1810紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1．2 樣品制備

取油茶蒲，粉碎后過(guò)50目篩，置于容器中，加入10倍質(zhì)量的水，30℃超聲波提取30 min上述提取液4 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液，真空濃縮干燥，得油茶蒲水提物，多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25．02%。

1．3 FAS 活性測(cè)定［9］

全反應(yīng)活性測(cè)定:活性測(cè)定采用分光光度法以5μmol/L乙酰輔酶 A，10μmol/L丙二酰輔酶 A，35μmol/L NADPH為底物，在含有1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DDT，100 mmol/L pH 7．0 的 KH2PO4－K2HPO4緩沖液中，37℃下保溫，加入10μg FAS啟動(dòng)反應(yīng)，監(jiān)測(cè)340 nm波長(zhǎng)處吸光度，以1 min中的吸光度的變化速率計(jì)算FAS活性。

1．4 FAS可逆抑制測(cè)定

可逆抑制的測(cè)定:被測(cè)萃取液樣品加到測(cè)活系統(tǒng)中，再加FAS啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定酶的活性為Ai，以萃取溶劑代替萃取液樣品的測(cè)活結(jié)果為Ao。Ai/Ao為剩余活性，此值越低抑制能力越強(qiáng)。此抑制通常為可逆抑制。

1．5 半抑制濃度的測(cè)定

半抑制濃度的測(cè)定:在不同的萃取液加量下測(cè)定對(duì)FAS的快結(jié)合抑制，以剩余活性對(duì)每毫升測(cè)活溶液含萃取物的干重(μg/mL)作圖。由剩余活性隨抑制劑量增加而降低的曲線上可估出活性被抑制一半時(shí)的抑制濃度即為半抑制濃度(IC50)。此參數(shù)值越小抑制能力越強(qiáng)。

1．6 FAS不可逆抑制的時(shí)間過(guò)程曲線

不可逆抑制的速度常數(shù)測(cè)定:抑制劑加到FAS溶液中，混勻后25℃放置，在不同的時(shí)間間隔取混合溶液測(cè)定酶活性At，只加同樣量的萃取溶劑時(shí)的測(cè)活作為對(duì)照Ao。At/Ao為該時(shí)刻的剩余活性(Remaining Activity，R．A．)。

1．7 小鼠預(yù)防性肥胖試驗(yàn)［10］

ICR小鼠在試驗(yàn)環(huán)境下喂普通飼料7 d，稱體重，隨機(jī)分成5組:正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(奧利司它50 mg/kg)、低劑量組(油茶蒲水提物150 mg/kg)、高劑量組(油茶蒲水提物300 mg/kg)。正常對(duì)照組動(dòng)物從試驗(yàn)開(kāi)始至結(jié)束用普通飼料喂養(yǎng)，其余各組動(dòng)物均喂?fàn)I養(yǎng)飼料。正常對(duì)照組、模型組每天灌胃給予等量蒸餾水，其余各組按上述劑量每天灌胃給予藥物。每周記錄體重1次;6周后，各組小鼠禁食12 h，稱重，眼眶采血，分離血清，隨即頸椎脫臼處死，取腎周及睪丸周圍脂肪，并快速取肝臟，稱重。

1．8 小鼠肝臟中FAS活性的測(cè)定

小鼠肝臟稱重后置冰中冷卻，加入1．8倍質(zhì)量冷的抽提緩沖液(0．1 mol/L磷酸鉀，0．07 mol/L碳酸氫鉀，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，pH 7．8)，高速勻漿1 min，隨即在4℃以下10 000 r/min離心30 min，得到高速離心上清液，測(cè)定其中的FAS活性。

2 結(jié)果與分析

2．1 油茶蒲水提物對(duì)脂肪酸合酶的可逆抑制作用

圖1為油茶蒲水提取對(duì)脂肪酸合酶可逆抑制的曲線?？梢钥闯鲇筒杵阉嵛飳?duì)脂肪酸合酶有很強(qiáng)的抑制作用，半抑制濃度 IC50僅為 1．72μg/mL。EGCG是茶葉中含量很高的酯型兒茶素，而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，它對(duì)脂肪酸合酶可逆抑制作用的半抑制濃度為23．82 μg/mL，其抑制作用遠(yuǎn)弱于油茶蒲水提物［10］。雖然油茶和日常飲用的綠茶同屬于山茶科山茶屬，但是對(duì)脂肪酸合酶的抑制作用仍存在很大的差異。

圖1 油茶蒲水提物對(duì)FAS的抑制曲線

2．2 油茶蒲水提物對(duì)脂肪合酶的不可逆抑制作用

將油茶蒲水提物與酶保溫，混合保溫體系中的樣品質(zhì)量濃度為25μg/mL，在不同的時(shí)間，測(cè)定酶的剩余活性，制作油茶蒲水提物對(duì)脂肪酸合酶的不可逆抑制曲線(圖2)。雖然油茶蒲水提物對(duì)FAS有很強(qiáng)的可逆抑制作用，但是加入到測(cè)活系統(tǒng)后，其質(zhì)量濃度只有0．2μg/mL，比其IC50小很多，其不可逆抑制作用幾乎可以忽略。通過(guò)測(cè)定0．2μg/mL時(shí)油茶蒲水提物對(duì)FAS的可逆抑制作用，以它作為酶的全反應(yīng)活性，對(duì)不可逆抑制的數(shù)據(jù)進(jìn)行修正，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)180 min后，酶活只剩下不到30%，酶活在開(kāi)始10 min快速下降，接著活性下降趨勢(shì)比較平緩。

圖2 油茶蒲水提物對(duì)FAS的不可逆抑制曲線

2．3 油茶蒲水提物的對(duì)小鼠體重的作用

圖3為試驗(yàn)小鼠的體重增重率的變化。給藥6周后，模型組與正常對(duì)照組的體重增重率顯著差異(P＜0．05)，造模成功(表1)?？梢园l(fā)現(xiàn)油茶蒲高劑量組的體重增重率明顯低于模型組(P＜0．01)，非常有意思的是油茶蒲低劑量組的體重增重率幾乎與正常對(duì)照組保持一致，但是與模型組的體重增長(zhǎng)率未有顯著性差異。而陽(yáng)性對(duì)照奧利司它對(duì)體重增重率的影響弱于油茶蒲高劑量組，但是強(qiáng)于油茶蒲低劑量組。因此，可以認(rèn)為油茶蒲水提物能夠有效預(yù)防小鼠肥胖的產(chǎn)生。

圖3 油茶蒲水提物對(duì)小鼠體重增重率的作用

2．4 油茶蒲水提物的對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)小鼠的血液的總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、瘦素(leptin)的分析(表2)，可以發(fā)現(xiàn)油茶蒲水提物高低劑量組均能極顯著地降低小鼠血液的三酰甘油(P＜0．01)。但是無(wú)論是陽(yáng)性藥物還是油茶蒲水提物均不能顯著改變小鼠血液的總膽固醇及高密度脂蛋白。瘦素是調(diào)節(jié)機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)水平的重要分子，對(duì)試驗(yàn)小鼠血清瘦素水平的分析，模型組的瘦素水平顯著高于正常對(duì)照組，由于瘦素是脂肪組織分泌的一種脂肪因子，機(jī)體脂肪含量增加，瘦素分泌增加，但是研究表明，肥胖是由于瘦素抵抗，使瘦素未能發(fā)生正常的生理功能所致［12］。油茶蒲水提物高劑量組的血清瘦素水平均較高脂飼料模型組低，雖然差異不顯著(P＞0．05)，但是體重卻得到了有效地降低，這說(shuō)明油茶蒲水提物能夠有效改善肥胖小鼠的瘦素抵抗作用，使其發(fā)揮生理作用，調(diào)節(jié)食欲及脂肪代謝，從而實(shí)現(xiàn)了小鼠體重的降低。

2．5 油茶蒲水提物的對(duì)試驗(yàn)小鼠肝臟FAS活性及體脂比的影響

表3為試驗(yàn)動(dòng)物的體脂比及肝臟FAS活性，小鼠的體脂比和肝臟FAS活性具有一定的正相關(guān)性。陽(yáng)性對(duì)照奧利司它和油茶蒲水提物均能有效降低小鼠的體脂比和肝臟FAS活性。其中油茶高劑量組無(wú)論在對(duì)降低體脂比還是肝臟FAS活性均與模型組有及顯著性差異(P＜0．01)，并作用效果強(qiáng)于陽(yáng)性藥物奧利司它。

表1 油茶蒲水提物對(duì)小鼠體重的作用

表2 油茶蒲水提物對(duì)小鼠的血液生化指標(biāo)的作用

表3 油茶蒲水提物對(duì)小鼠體脂比及肝臟FAS活性作用

3 討論與結(jié)論

油茶蒲水提物是FAS的高效抑制劑，其作用包括可逆抑制和不可逆抑制。油茶蒲中即可能含有EGCG等兒茶素類物質(zhì)，但是油茶蒲水提物對(duì)FAS的半抑制濃度為1．72μg/mL，遠(yuǎn)低于EGCG，因此推測(cè)油茶蒲中含有的一種或多種非兒茶素類抑制劑，可能是新的FAS抑制劑。

動(dòng)物試驗(yàn)表明油茶蒲水提物有很好的預(yù)防肥胖的作用。這可能與其對(duì)FAS的高效抑制作用相關(guān)。奧利司它是1999年美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的一個(gè)減肥藥，研究表明它是脂肪酸合酶的抑制劑［13］。而油茶蒲高劑量組無(wú)論在降低小鼠體重、體脂比還是肝臟的FAS活性均強(qiáng)于奧利司它。因此將油茶蒲中的減肥有效成分及其作用機(jī)理進(jìn)行深入研究，對(duì)于體重控制和肥胖防治有著十分積極的意義。

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Study on Anti－obesity Effects of Water Extracts from Hull of Camellia Oleifera Abel

Chen Qiuping1Jiang Tianjia1Ma Xiaofeng2Shen Jianfu1
(Department of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University1，Hangzhou 310058)
(Department of Biology，Graduate School of Chinese Academy of Sciences2Beijing 100039)

Fatty acid synthase(FAS)is reported as a potential therapeutic target for obesity．Our study suggested that the water extracts from the hull of Camellia oleifera Abel strongly inhibited FASin both reversible and irreversible manner in vitro．The half inhibition concentration(IC50)value of the water extracts on FAS was 1．72 μg/mL．In the presence of 25 μg/mL of the water extract in the inhibitor－FASsystem，remaining activity of FASwas no more than 30%within 180 min．In vivo，the results of preventive obese model indicated that 300 mg/kg water extracts could significantly reduce the increasing rate of body weight，body fat rate and liver FAS activity，which was more efficient than Orlistat．Therefore，the water extract of Camellia oleifera Abel had the potential to be an element of weight control functional food;its anti－obesity effect may be related to the inhibition effect on FAS．

water extracts of Camellia oleifera Abel，fatty acid synthase(FAS)，anti－ obesity，inhibitor

R285．5

A

1003－0174(2011)09－0066－04

浙江省自然科學(xué)基金(Y305239)

2010－10－12

陳秋平，女，1984年出生，博士，天然產(chǎn)物的應(yīng)用

沈建福，男，1964年出生，副教授，糧油加工